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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.16781
研究内容
德國萊比錫大學Severin Sasso教授上司的研究團隊在The Plant Journal上發表的最新研究中，對萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）組蛋白基因内的順式激活調控元件（CREs）進行了深入的鑒定與表征。該研究不僅揭示了基因表達調控的新機制，加深了我們對真核生物中增強子和CREs功能的認識，而且為萊茵衣藻在生物技術領域的應用，如生物能源生産、環境修複和作物改良等，提供了關鍵的遺傳工具和分子生物學基礎。
研究背景
順式調控子產品CRM，Cis-Regulatory Module）是基因組中的特定DNA序列，它們負責調控基因的表達模式。CRMs由啟動子、增強子、沉默子和絕緣子等多種順式調控元件(CRE, Cis-Regulatory Element）組成。通過與轉錄因子等反式作用因子結合，CRMs能夠增強或抑制基因的轉錄，進而調控基因表達的強度、時間和空間分布。CRMs在生物體的發育、細胞類型特異性表達、以及對環境變化的響應中起着至關重要的作用，是生物體内基因表達調控網絡的關鍵組成部分。
主要結果
1. 鑒定組蛋白中保守的CREs
在萊茵衣藻的組蛋白基因中，研究人員鑒定了四個保守的順式激活元件（CREs），其中EH3/H4、EH2A/H2B這兩個元件在萊茵衣藻組蛋白基因間區域保守存在，Eupstr在高表達核基因的轉錄起始位點（TSS）上遊約65 bp處高度富集，Ehist cons元件則是一個在被子植物和萊茵衣藻組蛋白基因區域普遍存在，高度保守的8個堿基（稱為Oct基序）序列（圖1）。
圖1 EH3/H4、EH2A/H2B、Eupstr和Ehist cons元件的相對位置和它們在基因組中的保守性。
2. 報告載體的建構與活性測試
研究人員建構了包含4X CRE、啟動子和mCerulean3熒光蛋白基因的報告載體，并将其整合到萊茵衣藻的核基因組中，通過流式細胞儀量化了CRE激活活性（圖2）。在對四個候選激活CRE的活性評估中發現，EH3/H4、EH2A/H2B這兩個元件并沒有顯示出對報告基因表達的上調作用。Eupstr能夠顯著增強mCerulean3熒光蛋白的表達，并且其增強效果與強啟動子PHSP70A-RBCS2相當（圖3）。
圖2：實驗流程圖：通過電穿孔将含有CRE、啟動子和mCerulean3熒光報告基因的載體轉入萊茵衣藻的核基因組，然後通過流式細胞儀量化報告基因的表達。
圖3：四個候選激活CREs（EH3/H4、EH2A/H2B、Eupstr和Ehist cons）的活性評估。通過流式細胞儀測量的mCerulean3熒光強度，可以用來比較這些CREs是否能夠增強PRBCS2啟動子的活性。
3. 探究影響Eupstr激活效果的因素
在本文中，研究人員對Eupstr這一順式激活調控元件（CRE）的功能特性進行了進一步研究。1.探究了Eupstr的活性與數量的關系，當使用8X Eupstr與RBCS2啟動子結合時，mCerulean3熒光蛋白的表達水準下降至與單獨RBCS2啟動子相當的水準，增加CRE的數量至8個拷貝并不會增強其激活效果（圖4b）。2. Eupstr與強啟動子PHSP70A-RBCS2的結合是并不會增強其激活活性（圖4c）。3. Eupstr的激活效果是位置依賴性的，但與方向無關。當Eupstr位于RBCS2啟動子的上遊時，能夠顯著提高基因表達，而當Eupstr位于下遊時，這種激活效應則消失,且Eupstr的方向變化并不影響其激活活性（圖5）。4.在測試Eupstr與啟動子的距離依賴性時，通過在Eupstr和啟動子之間插入一個1.5-kb的間隔，發現Eupstr未能在這個距離上激活RBCS2啟動子，這表明Eupstr的激活作用具有一定的距離限制（圖7b），而Ehist cons即使在1.5-kb的距離上也能提高基因表達（圖7c）。這些發現為了解Eupstr在基因表達調控中的作用提供了重要的見解，并為未來在萊茵衣藻及其他可能的生物體系中應用Eupstr作為遺傳工具提供了實驗依據。
圖4 評估了8X Eupstr和與PHSP70A-RBCS2組合的效果。
圖5 評估了Eupstr的位置和方向依賴性。
圖7 評估了Eupstr和Ehist cons的距離依賴性。
4. 順式激活調控元件在生物技術應用中的潛力
激活CREs在生物技術領域，特别是在基因工程中的應用，已經在被子植物中得到了較為廣泛的探索和利用，而在萊茵衣藻中的應用相對較少，可能是由于缺乏關于CREs激活的基因表達長期穩定性的資料。為了測試激活CREs是否能夠支援長期的基因表達，研究人員将含有Eupstr與RBCS2啟動子結合的報告載體轉化到萊茵衣藻中。通過對轉化後的細胞進行流式細胞術分析，發現高表達mCerulean3的細胞比例在經過篩選和傳代後有所下降，表明過表達的核基因在萊茵衣藻中的表達是中等穩定的。
圖8 Eupstr激活的mCerulean3表達的穩定性。
研究人員在一個經過專利認證的菌株UVM11-CW中進一步驗證了Eupstr的激活功能，即便在缺乏順式激活元件（CRE）的條件下，PRBCS2啟動子在UVM11-CW中也能夠有效地驅動基因的高水準表達。當Eupstr存在時會進一步提升報告基因的表達，這一結果進一步證明了激活型CREs在增強基因表達方面的有效性。總體而言，Eupstr和Ehist cons這兩個激活型CREs已被證明能夠在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的核基因組中激活基因表達。這些特定的CRE-啟動子組合不僅為實作目标基因的過表達提供了新的政策，而且為其他生物技術應用，如合成生物學和基因工程，開辟了新的可能性。
圖9 Eupstr在萊茵衣藻UVM11-CW菌株中的基因上調作用。
結論
本文深入研究了萊茵衣藻中組蛋白基因的順式激活調控元件（CREs），通過建構報告基因系統并利用流式細胞術，研究發現了兩個具有顯著上調基因表達功能的CREs，即Eupstr和Ehist cons。Eupstr是一個不依賴于方向的CRE，能夠激活RBCS2和β2-tubulin啟動子，而Ehist cons則顯示出與特定啟動子的結合特異性。此外，研究還探讨了這些CREs的位置、方向和距離依賴性，以及它們在生物技術中的應用潛力。這些發現不僅擴充了我們對萊茵衣藻基因表達調控機制的認識，而且為利用這些順式調控元件進行基因工程和合成生物學研究提供了新的工具。
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