文|面包夹知识
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«——【·前言·】——»
菲律宾蛤仔是大陆单种产量最高的养殖贝类，年产量超过400万t，占世界总产量的90％。
近年来，伴随蛤仔养殖密度增加及海水水质恶化，蛤仔病害频发，加之蛤仔种质资源退化、良种覆盖率低、南苗北养等问题的存在，养殖蛤仔成活率下降，给蛤仔养殖业造成经济损失。
水产养殖病害防控的传统方法是通过施加抗生素、使用化学消毒剂或照射紫外线等杀灭水环境微生物，这些方法没有选择性，不能从根本上解决水产养殖病害问题，而且抗生素、消毒剂的大量使用会引发生态问题。
为保证水产养殖业持续健康发展，水产益生菌作为化学制剂的替代品，正被广泛应用于水产养殖中，其具有无毒、不产生抗药性、高丰度和低成本等优点。
在养殖水环境中，一方面，益生菌可以维持水体微生态平衡，抑制和防止有害菌滋生，降低水产动物患病风险；另一方面，益生菌在水产动物肠道的定植能够增强水产动物对饲料的消化吸收能力，并通过占位效应阻止致病菌侵袭，提高养殖动物成活率。
目前，国内外应用于水产养殖的益生菌包括芽孢杆菌属（Bacillussp.）、乳球菌属（Lactococcussp.）、乳杆菌属（Lactococcussp.）、片球菌属（Pediococcussp.）、肠球菌属（Enterococcussp.）、链球菌属（Streptococcussp.）等。
那么从健康蛤仔肠道分离可培养细菌，通过体外产酶试验、安全性评价、养殖试验筛选出的具有益生作用的益生菌的方法，怎样提高它的成活率呢？
«——【·分离方法·】——»
从辽宁省庄河市石城乡上品堂养殖基地采集试验用菲律宾蛤仔样品(平均体质量（14.51±1.18）g,平均壳长（3.74±0.15）cm)，在超净工作台下用75%酒精擦拭蛤仔外壳进行表面消毒，使用灭菌解剖刀解剖蛤仔，取出肠道组织，用无菌海水冲洗肠道内容物3次，再将肠道组织用无菌海水匀浆，制成蛤仔肠道组织悬浊液。
用无菌海水对蛤仔肠道组织悬浊液进行梯度稀释，稀释倍数分别为10、100、103、104、105、106和107倍。
对稀释至10-4、10-5、10-6和10-7的匀浆液，分别取0.1mL均匀涂布到2216E固体培养基上，设3组平行，25℃倒置恒温培养72h后观察，挑取颜色、形态不同的菌落进行平板划线分离纯化得到单一菌落，编号并保种。
取待测菌株在2216E固体培养基上进行活化，将活化好的菌株接种至LB（2.5%的NaCl）液体培养基中，恒温培养摇床25℃、120r/min，震荡培养24h后，取上述菌液2.5µL，点种于哥伦比亚血琼脂平板上，25℃培养24h，观察菌落周围形成的溶血环判断溶血类型。
采用点种法测定菌株的产酶能力，取2.5µL新鲜菌液分别点种于淀粉酶选择培养基、蛋白酶选择培养基、脂酶（Tween80）选择培养基上，25℃培养72h，淀粉酶选择培养基使用1%的卢戈氏碘液染色观察菌落周围水解圈，记录淀粉酶水解圈直径与菌落直径；
观察蛋白酶选择培养基中菌落周围有无透明水解圈，记录蛋白酶水解圈直径与菌落直径；观察脂酶选择培养基中菌落周围有无晕圈，记录晕圈直径与菌落直径。
从2216E固体培养基上挑取单菌落，接种至2216E液体培养基中，摇床培养（25℃、120rpm），取30µL菌液进行革兰氏染色，进行油镜镜检，结合菌株在培养基上的菌落形态和显微镜下的细菌形态及颜色，对其进行初步分类。
采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增，30µL反应体系包含：2μL模板DNA、3μL正向引物27F(10μmol/L)、3μL反向引物1492R(10μmol/L)、15μL2×EasyTaqPCRsuperMix、7μLddH2O。
反应程序为:95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次，72℃总体延伸5min，20℃保存。
PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察是否有明亮条带，将扩增成功的PCR产物送至华大基因进行测序。
将测序结果提交GenBank进行Blast比对分析，并选取同源性较高的序列，采用MEGA7.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)基于泊松模型计算遗传距离构建种系型系统发育树，鉴定产酶细菌种属。
挑取产酶细菌单菌落，置于含NaCl量为2.5%LB液体培养基中25℃、120r/min摇床培养24h，制成菌悬液。
按10%接种量将15mL菌悬液接种至150mL的LB液体培养基中，每隔6h取样一次，每次取样5mL，空白培养液作为对照，校正零点，使用分光光度计测定其在600nm波长下的吸光度。
若吸光度值超过0.8，需稀释样品使其数值低于0.8，以测定时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
为了快速准确定量菌液，采用平板计数法绘制吸光度值-菌体数标准曲线，取对数生长期菌悬液，梯度稀释后测定其在600nm波长下的吸光度。
将稀释后的菌液涂布到含2.5%NaCl的LB琼脂平板上，每组3个重复，25℃培养24h后，选取菌落数在30至300之间的平板进行计数并计算菌落形成单位（CFU），再以同一菌液的OD600nm为横坐标、CFU为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程式。
为了测定菌株C26对酸的耐受性，取对数生长期菌液，稀释至1×109cfu/mL，按1%的接种量分别接种至pH为3.5、4.5、5.5和6.5的LB（含2.5%NaCl）液体培养基中（使用0.1mol/LHCl溶液和0.1mol/LNaOH溶液调节培养基的pH），25℃、120r/min摇床培养24h，分别在0h、2h、4h、8h、24h测定菌液的OD600nm值，设置三组重复。
为了测定菌株C26对胆盐的耐受性，取对数生长期菌液，稀释至1×109cfu/mL，按1%的接种量分别接种至分别添加了质量浓度为0、0.1、0.3、0.5g/100mL牛胆盐（购自金克隆生物技术有限公司）的LB（pH8.0，含2.5%NaCl）液体培养基中（使用0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/LHCl溶液调节培养基pH），25℃、120rpm摇床培养24h，分别在0h、2h、4h、8h、24h测定菌液的OD600nm值。设置三组重复。
从山东昌邑养殖池塘内采集健康蛤仔幼贝（壳长0.3~0.5cm）用于攻毒试验，先在实验室暂养7d，养殖过程中水温恒定在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量换水。
取4个8L塑料桶，消毒清洗后分别放入4L灭菌过滤海水及100只蛤仔幼贝。将4桶幼贝随机分为2组，每组2桶，1组为投喂日常饵料的对照组，1组为施加潜在益生菌的攻毒试验组。
根据菌株细胞浓度标准曲线定量移取菌液置无菌离心管中，6000r/min离心5min后去上清，重悬于适量无菌海水中制备成菌悬液，将适量菌悬液加入试验组使水体菌株终浓度为5×107cfu/mL。
攻毒试验过程中水温恒定保持在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量换水，每次换水时对攻毒试验组重新添加菌液至终浓度为5×107cfu/mL。每日观察记录幼贝的死亡情况，攻毒试验周期为5d。
采用纸片琼脂扩散法（K-B法）检测筛选出的产酶益生菌对抗菌药物的敏感度。
选购8种抗生素进行药敏试验，分别是四环素、卡那霉素、头孢氨卡、青霉素、红霉素、氯霉素、复方新诺明、诺氟沙星。
用灭菌棉签蘸取浓度为1×108cfu/mL的菌液少许均匀涂布于2216E固体培养基，将药敏纸片贴于表面，35℃培养24h后测定抑菌圈直径大小，重复3次计算平均值，根据药敏纸片说明书判定其敏感性。
从山东昌邑养殖池塘内采集健康蛤仔幼贝（体质量0.4~0.5g，壳长1.25~1.27cm）用于养殖试验，在实验室暂养7d，养殖过程中水温恒定在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量换水。取6个塑料桶，消毒清洗后分别放入2L灭菌过滤海水及50只蛤仔幼贝。
分别称量每桶蛤仔的总重量，并用游标卡尺测量单只蛤仔的壳长、壳宽和壳高。
将6桶幼贝随机分为2组，每组3桶，1组为投喂日常饵料的对照组，1组为施加潜在益生菌的养殖试验组。
根据菌株细胞浓度标准曲线定量移取菌液置无菌离心管中，6000r/min离心5min后去上清，重悬于适量无菌海水中制备成菌悬液，将适量菌悬液加入试验组使水体菌株终浓度为1×107cfu/mL。
养殖试验过程中水温恒定保持在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量换水，每次换水时对养殖试验组重新添加菌液至终浓度为1×107cfu/mL。
至60d养殖试验结束后，再次称量每桶蛤仔的总重量，并用游标卡尺测量单只蛤仔的壳长、壳宽和壳高。
根据以下公式分别计算蛤仔幼贝增长率：
增重率（WGR，%）=（最终重量-最初重量）/最初重量×100%，
日增壳长（μm/day）=（最终壳长-初始壳长）/养殖时间×1000，
日增壳宽（μm/day）=（最终壳宽-初始壳宽）/养殖时间×1000，
日增壳高（μm/day）=（最终壳高-初始壳高）/养殖时间×1000。
试验数据以平均值±标准差（mean±S.D.）表示，使用SPSS软件进行单因素方差分析（one-wayANOVA）进行组间差异显著性比较（P<0.05代表显著性差异，P<0.01代表极显著差异）。使用Origin软件进行作图。
«——【·结果与分析·】——»
从健康蛤仔肠道中共分离获得21株可培养细菌，对其进行溶血试验，结果表明这21株细菌均不产生β-溶血环，提示其均不具备溶血性。
分别检测这21株细菌产淀粉酶、产蛋白酶和产脂肪酶的能力，结果如表1所示。
受试的21株细菌中有8株产淀粉酶，7株产蛋白酶，8株产脂肪酶，6株未检测出产酶能力。
其中，菌株C26同时具备产淀粉酶、产蛋白酶和产脂肪酶的能力,其产酶水解圈直径（R）与菌落平均直径（r）的比值（R/r）分别为1.91±0.25（淀粉酶）、1.93±0.05（蛋白酶）和1.48±0.03（脂肪酶）。
因此，以菌株C26为研究对象，进行后续蛤仔安全试验和养殖试验，检测其作为蛤仔益生菌的潜力。
菌株C26在2216E固体培养基上的菌落为圆形，边缘整齐，中部微微凸起，表面光滑，呈不透明浅黄色。
取对数生长期细胞进行革兰氏染色，结果如图1所示，显微视野下，菌株C26细胞为红色，呈杆状、短杆状，鉴定其为革兰氏阴性杆菌。
对筛选得到C26菌株进行16SrDNA序列测序，在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行序列比对，利用MEGA7.0软件制作系统发育树（见图2）。
检测结果表明：菌株C26与假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）同源性较高，在98%覆盖度下一致性最高为99.44%，包括P.sp.BSi20396（EU330365.1）、P.sp.BSi20139（DQ492721.1）、P.sp.AC-144（AJ519790.1）等，在99%覆盖度下与P.sp.LP621（EU849123.1）一致性为99.24%。
选取11株假交替单胞菌属不同种的细菌，包括同源性最高的P.sp.BSi20396、P.sp.BSi20139、P.sp.AC-144以及在99%覆盖度下同源性最高P.sp.LP621与菌株C26构建系统发育分析，如图3所示，只能鉴定菌株C26为假交替单胞菌属，无法鉴定到种。
结合菌株C26的菌落形态，显微形态以及序列比对分析，将潜在益生菌C26初步鉴定为假交替单胞菌属。
菌株C26在室温、LB液体培养基（含2.5%NaCl）中生长曲线如图3所示，其生长延迟期较长，至24h才进入对数生长期，至36h进入稳定期，对数生长期菌液OD600nm数值在1.0~2.5之间。
取不同浓度菌株C26在LB液体培养基（含2.5%NaCl）中的菌液（对数生长期），用空白培养基稀释后测定其OD600nm，并将同批稀释菌液涂布到LB琼脂平板（含2.5%NaCl），24h后观察记录菌落数量并计算菌落形成单位CFU(colonyformingunit)。
以同一稀释菌液的OD600nm为横坐标、CFU为纵坐标绘制标准曲线，如图4所示，得到回归方程式y=109x-9×106（R2=0.9974），用于后续计算C26菌液浓度。
为了检验菌株C26对动物肠道环境的耐受性，对其分别进行耐酸试验和耐胆盐试验。
分别测定菌株C26室温下在pH为3.5、4.5、5.5和6.5的LB（含2.5%NaCl）液体培养基中的生长状况，结果如图5所示。
在24h培养周期内，在pH6.5和pH5.5的培养基中培养的C26生长良好，菌液OD600nm呈上升趋势，至8h稳定。
培养8h和24h，在pH6.5的培养基中C26菌液OD600nm均达到1.0左右，在pH5.5的培养基中C26菌液OD600nm均达到0.9至1.0之间。
而在pH3.5和pH4.5的培养基中，C26生长受到抑制，24h培养周期内菌液OD600nm维持在初始值，未见增长。
结果表明，菌株C26在pH不低于5.5的酸性环境中生长良好，在pH低于4.5时生长受到抑制。
测定菌株C26室温下在含胆盐质量浓度为0、0.1、0.3、0.5g/100mL的LB（pH8.0，含2.5%NaCl）液体培养基中的生长状况，结果如图6所示。
24h培养周期内，空白对照组（不含胆盐）菌液OD600nm整体呈上升趋势，在培养4h后显著增长，至8h和24h分别达到0.48±0.10和0.73±0.05。
在含0.1g/100mL胆盐的培养基中，菌液OD600nm呈现增长（2h）、下降（4h）、再增长（8h，24h）的变化趋势，2h和4h的数值分别为0.16±0.02和0.12±0.02，至8h达到0.39±0.06，至24h为0.48±0.05，其峰值显著低于空白对照组峰值（P＜0.05）。
在含0.3g/100mL和0.5g/100mL胆盐的培养基中，菌液OD600nm也呈现增长（2h）、下降（4h）、再增长（8h，24h）的变化趋势，24h峰值分别为0.16±0.04（含0.3g/100mL胆盐）、0.13±0.04（含0.5g/100mL胆盐），显著低于空白对照组和含低浓度胆盐组。
结果表明，胆盐在0.1g/100mL的浓度即可抑制菌株C26的生长，在高于0.3g/100mL的浓度能极显著抑制菌株C26的生长。
为检验菌株C26对蛤仔的安全性，选取蛤仔幼贝为试验对象，采用菌液浸浴法进行攻毒试验，试验周期为5d。
取C26对数生长期菌液，按细胞终浓度为5×107cfu/mL的剂量施加到攻毒试验组，每两天换水一次，每次换水时重新施加新鲜菌液，试验周期内共计施加3次（0d，2d，4d）。
攻毒试验结果如表2所示，两组试验组蛤仔幼贝的5d存活率均为93%，而两组对照组蛤仔幼贝的5d存活率分别为96%和95%，试验组幼贝存活率略低于对照组，但均高于90%，据此推断菌株C26在5×107cfu/mL的浸浴浓度下对蛤仔幼贝安全无毒，可作为潜在益生菌进行后续试验。
为检测菌株C26的抗生素敏感性，选取四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类等七大类共计8种抗生素，分别测定菌株C26对这些抗生素的敏感性，结果如表3所示。
菌株C26对四环素、卡那霉素和头孢氨苄耐受，对红霉素和青霉素中度敏感，而对复方新诺明、诺氟沙星和氯霉素敏感。
菌株C26对蛤仔生长的影响结果如图7所示。
空白对照组蛤仔幼贝的初始总重量为22.40±0.33g，试验周期结束时总重量为（24.00±0.40）g，平均增重率为7.10%±0.71%。
试验组蛤仔幼贝的初始总重量为（23.38±0.20）g，经60d浸浴试验后总重量为（25.57±0.09）g，平均增重率为9.37%±0.53%。试验组蛤仔幼贝增重率显著高于对照组（P＜0.05）。
在养殖试验周期内，对照组蛤仔幼贝日增壳长、日增壳高、日增壳宽分别为（14.68±1.02）µm/d、（11.96±1.01）µm/d和（10.47±0.45）µm/d，试验组蛤仔幼贝日增壳长、日增壳高、日增壳宽分别为（15.01±0.47）µm/d、（11.99±0.94）µm/d和（11.10±0.50）µm/d。
与对照组相比，试验组蛤仔壳规格日增值差异不显著（P＞0.05）。结果表明，菌株C26浸浴处理能显著提高蛤仔幼贝增重率。
«——【·结语·】——»
从健康菲律宾蛤仔肠道中分离筛选获得1株能够产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的细菌C26，经鉴定该菌株为假交替单胞菌属细菌。
结果表明菌株C26耐酸、耐胆盐试验结果表明，菌株C26在强酸和高浓度胆盐的条件下，活菌数量未减少且仍呈上升趋势，表明菌株C26具有较强的酸性耐受性和胆盐耐受性。
结果表明蛤仔幼贝在菌株C26浸浴浓度高达5×107cfu/mL的条件下，5d存活率仍高于90%，表明菌株C26对蛤仔幼贝安全无毒。
为期60d的养殖试验结束后，菌株C26处理组的增重率为9.37%±0.53%，相较于空白对照组7.10%±0.71%的增重率有显著提高（P＜0.05），表明菌株C26对蛤仔幼贝的生长具有促进作用。