文|面包夾知識
編輯|面包夾知識
«——【·前言·】——»
菲律賓蛤仔是大陸單種産量最高的養殖貝類，年産量超過400萬t，占世界總産量的90％。
近年來，伴随蛤仔養殖密度增加及海水水質惡化，蛤仔病害頻發，加之蛤仔種質資源退化、良種覆寫率低、南苗北養等問題的存在，養殖蛤仔成活率下降，給蛤仔養殖業造成經濟損失。
水産養殖病害防控的傳統方法是通過施加抗生素、使用化學消毒劑或照射紫外線等殺滅水環境微生物，這些方法沒有選擇性，不能從根本上解決水産養殖病害問題，而且抗生素、消毒劑的大量使用會引發生态問題。
為保證水産養殖業持續健康發展，水産益生菌作為化學制劑的替代品，正被廣泛應用于水産養殖中，其具有無毒、不産生抗藥性、高豐度和低成本等優點。
在養殖水環境中，一方面，益生菌可以維持水體微生态平衡，抑制和防止有害菌滋生，降低水産動物患病風險；另一方面，益生菌在水産動物腸道的定植能夠增強水産動物對飼料的消化吸收能力，并通過占位效應阻止緻病菌侵襲，提高養殖動物成活率。
目前，國内外應用于水産養殖的益生菌包括芽孢杆菌屬（Bacillussp.）、乳球菌屬（Lactococcussp.）、乳杆菌屬（Lactococcussp.）、片球菌屬（Pediococcussp.）、腸球菌屬（Enterococcussp.）、鍊球菌屬（Streptococcussp.）等。
那麼從健康蛤仔腸道分離可培養細菌，通過體外産酶試驗、安全性評價、養殖試驗篩選出的具有益生作用的益生菌的方法，怎樣提高它的成活率呢？
«——【·分離方法·】——»
從遼甯省莊河市石城鄉上品堂養殖基地采集試驗用菲律賓蛤仔樣品(平均體品質（14.51±1.18）g,平均殼長（3.74±0.15）cm)，在超淨工作台下用75%酒精擦拭蛤仔外殼進行表面消毒，使用滅菌解剖刀解剖蛤仔，取出腸道組織，用無菌海水沖洗腸道内容物3次，再将腸道組織用無菌海水勻漿，制成蛤仔腸道組織懸濁液。
用無菌海水對蛤仔腸道組織懸濁液進行梯度稀釋，稀釋倍數分别為10、100、103、104、105、106和107倍。
對稀釋至10-4、10-5、10-6和10-7的勻漿液，分别取0.1mL均勻塗布到2216E固體培養基上，設3組平行，25℃倒置恒溫培養72h後觀察，挑取顔色、形态不同的菌落進行平闆劃線分離純化得到單一菌落，編号并保種。
取待測菌株在2216E固體培養基上進行活化，将活化好的菌株接種至LB（2.5%的NaCl）液體培養基中，恒溫培養搖床25℃、120r/min，震蕩培養24h後，取上述菌液2.5µL，點種于哥倫比亞血瓊脂平闆上，25℃培養24h，觀察菌落周圍形成的溶血環判斷溶血類型。
采用點種法測定菌株的産酶能力，取2.5µL新鮮菌液分别點種于澱粉酶選擇培養基、蛋白酶選擇培養基、脂酶（Tween80）選擇培養基上，25℃培養72h，澱粉酶選擇培養基使用1%的盧戈氏碘液染色觀察菌落周圍水解圈，記錄澱粉酶水解圈直徑與菌落直徑；
觀察蛋白酶選擇培養基中菌落周圍有無透明水解圈，記錄蛋白酶水解圈直徑與菌落直徑；觀察脂酶選擇培養基中菌落周圍有無暈圈，記錄暈圈直徑與菌落直徑。
從2216E固體培養基上挑取單菌落，接種至2216E液體培養基中，搖床培養（25℃、120rpm），取30µL菌液進行革蘭氏染色，進行油鏡鏡檢，結合菌株在培養基上的菌落形态和顯微鏡下的細菌形态及顔色，對其進行初步分類。
采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增，30µL反應體系包含：2μL模闆DNA、3μL正向引物27F(10μmol/L)、3μL反向引物1492R(10μmol/L)、15μL2×EasyTaqPCRsuperMix、7μLddH2O。
反應程式為:95℃預變性2min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循環35次，72℃總體延伸5min，20℃儲存。
PCR擴增産物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察是否有明亮條帶，将擴增成功的PCR産物送至華大基因進行測序。
将測序結果送出GenBank進行Blast比對分析，并選取同源性較高的序列，采用MEGA7.0軟體，采用鄰接法(Neighbor-Joining)基于泊松模型計算遺傳距離建構種系型系統發育樹，鑒定産酶細菌種屬。
挑取産酶細菌單菌落，置于含NaCl量為2.5%LB液體培養基中25℃、120r/min搖床培養24h，制成菌懸液。
按10%接種量将15mL菌懸液接種至150mL的LB液體培養基中，每隔6h取樣一次，每次取樣5mL，空白培養液作為對照，校正零點，使用分光光度計測定其在600nm波長下的吸光度。
若吸光度值超過0.8，需稀釋樣品使其數值低于0.8，以測定時間為橫坐标，OD600nm值為縱坐标，繪制生長曲線。
為了快速準确定量菌液，采用平闆計數法繪制吸光度值-菌體數标準曲線，取對數生長期菌懸液，梯度稀釋後測定其在600nm波長下的吸光度。
将稀釋後的菌液塗布到含2.5%NaCl的LB瓊脂平闆上，每組3個重複，25℃培養24h後，選取菌落數在30至300之間的平闆進行計數并計算菌落形成機關（CFU），再以同一菌液的OD600nm為橫坐标、CFU為縱坐标繪制标準曲線并得到回歸方程式。
為了測定菌株C26對酸的耐受性，取對數生長期菌液，稀釋至1×109cfu/mL，按1%的接種量分别接種至pH為3.5、4.5、5.5和6.5的LB（含2.5%NaCl）液體培養基中（使用0.1mol/LHCl溶液和0.1mol/LNaOH溶液調節培養基的pH），25℃、120r/min搖床培養24h，分别在0h、2h、4h、8h、24h測定菌液的OD600nm值，設定三組重複。
為了測定菌株C26對膽鹽的耐受性，取對數生長期菌液，稀釋至1×109cfu/mL，按1%的接種量分别接種至分别添加了品質濃度為0、0.1、0.3、0.5g/100mL牛膽鹽（購自金克隆生物技術有限公司）的LB（pH8.0，含2.5%NaCl）液體培養基中（使用0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol/LHCl溶液調節培養基pH），25℃、120rpm搖床培養24h，分别在0h、2h、4h、8h、24h測定菌液的OD600nm值。設定三組重複。
從山東昌邑養殖池塘内采集健康蛤仔幼貝（殼長0.3~0.5cm）用于攻毒試驗，先在實驗室暫養7d，養殖過程中水溫恒定在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量換水。
取4個8L塑膠桶，消毒清洗後分别放入4L滅菌過濾海水及100隻蛤仔幼貝。将4桶幼貝随機分為2組，每組2桶，1組為投喂日常餌料的對照組，1組為施加潛在益生菌的攻毒試驗組。
根據菌株細胞濃度标準曲線定量移取菌液置無菌離心管中，6000r/min離心5min後去上清，重懸于适量無菌海水中制備成菌懸液，将适量菌懸液加入試驗組使水體菌株終濃度為5×107cfu/mL。
攻毒試驗過程中水溫恒定保持在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量換水，每次換水時對攻毒試驗組重新添加菌液至終濃度為5×107cfu/mL。每日觀察記錄幼貝的死亡情況，攻毒試驗周期為5d。
采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）檢測篩選出的産酶益生菌對抗菌藥物的敏感度。
選購8種抗生素進行藥敏試驗，分别是四環素、卡那黴素、頭孢氨卡、青黴素、紅黴素、氯黴素、複方新諾明、諾氟沙星。
用滅菌棉簽蘸取濃度為1×108cfu/mL的菌液少許均勻塗布于2216E固體培養基，将藥敏紙片貼于表面，35℃培養24h後測定抑菌圈直徑大小，重複3次計算平均值，根據藥敏紙片說明書判定其敏感性。
從山東昌邑養殖池塘内采集健康蛤仔幼貝（體品質0.4~0.5g，殼長1.25~1.27cm）用于養殖試驗，在實驗室暫養7d，養殖過程中水溫恒定在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量換水。取6個塑膠桶，消毒清洗後分别放入2L滅菌過濾海水及50隻蛤仔幼貝。
分别稱量每桶蛤仔的總重量，并用遊标卡尺測量單隻蛤仔的殼長、殼寬和殼高。
将6桶幼貝随機分為2組，每組3桶，1組為投喂日常餌料的對照組，1組為施加潛在益生菌的養殖試驗組。
根據菌株細胞濃度标準曲線定量移取菌液置無菌離心管中，6000r/min離心5min後去上清，重懸于适量無菌海水中制備成菌懸液，将适量菌懸液加入試驗組使水體菌株終濃度為1×107cfu/mL。
養殖試驗過程中水溫恒定保持在（21±2）℃，每日投喂3次小球藻，每2d全量換水，每次換水時對養殖試驗組重新添加菌液至終濃度為1×107cfu/mL。
至60d養殖試驗結束後，再次稱量每桶蛤仔的總重量，并用遊标卡尺測量單隻蛤仔的殼長、殼寬和殼高。
根據以下公式分别計算蛤仔幼貝增長率：
增重率（WGR，%）=（最終重量-最初重量）/最初重量×100%，
日增殼長（μm/day）=（最終殼長-初始殼長）/養殖時間×1000，
日增殼寬（μm/day）=（最終殼寬-初始殼寬）/養殖時間×1000，
日增殼高（μm/day）=（最終殼高-初始殼高）/養殖時間×1000。
試驗資料以平均值±标準差（mean±S.D.）表示，使用SPSS軟體進行單因素方差分析（one-wayANOVA）進行組間差異顯著性比較（P<0.05代表顯著性差異，P<0.01代表極顯著差異）。使用Origin軟體進行作圖。
«——【·結果與分析·】——»
從健康蛤仔腸道中共分離獲得21株可培養細菌，對其進行溶血試驗，結果表明這21株細菌均不産生β-溶血環，提示其均不具備溶血性。
分别檢測這21株細菌産澱粉酶、産蛋白酶和産脂肪酶的能力，結果如表1所示。
受試的21株細菌中有8株産澱粉酶，7株産蛋白酶，8株産脂肪酶，6株未檢測出産酶能力。
其中，菌株C26同時具備産澱粉酶、産蛋白酶和産脂肪酶的能力,其産酶水解圈直徑（R）與菌落平均直徑（r）的比值（R/r）分别為1.91±0.25（澱粉酶）、1.93±0.05（蛋白酶）和1.48±0.03（脂肪酶）。
是以，以菌株C26為研究對象，進行後續蛤仔安全試驗和養殖試驗，檢測其作為蛤仔益生菌的潛力。
菌株C26在2216E固體培養基上的菌落為圓形，邊緣整齊，中部微微凸起，表面光滑，呈不透明淺黃色。
取對數生長期細胞進行革蘭氏染色，結果如圖1所示，顯微視野下，菌株C26細胞為紅色，呈杆狀、短杆狀，鑒定其為革蘭氏陰性杆菌。
對篩選得到C26菌株進行16SrDNA序列測序，在GenBank資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行序列比對，利用MEGA7.0軟體制作系統發育樹（見圖2）。
檢測結果表明：菌株C26與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）同源性較高，在98%覆寫度下一緻性最高為99.44%，包括P.sp.BSi20396（EU330365.1）、P.sp.BSi20139（DQ492721.1）、P.sp.AC-144（AJ519790.1）等，在99%覆寫度下與P.sp.LP621（EU849123.1）一緻性為99.24%。
選取11株假交替單胞菌屬不同種的細菌，包括同源性最高的P.sp.BSi20396、P.sp.BSi20139、P.sp.AC-144以及在99%覆寫度下同源性最高P.sp.LP621與菌株C26建構系統發育分析，如圖3所示，隻能鑒定菌株C26為假交替單胞菌屬，無法鑒定到種。
結合菌株C26的菌落形态，顯微形态以及序列比對分析，将潛在益生菌C26初步鑒定為假交替單胞菌屬。
菌株C26在室溫、LB液體培養基（含2.5%NaCl）中生長曲線如圖3所示，其生長延遲期較長，至24h才進入對數生長期，至36h進入穩定期，對數生長期菌液OD600nm數值在1.0~2.5之間。
取不同濃度菌株C26在LB液體培養基（含2.5%NaCl）中的菌液（對數生長期），用空白培養基稀釋後測定其OD600nm，并将同批稀釋菌液塗布到LB瓊脂平闆（含2.5%NaCl），24h後觀察記錄菌落數量并計算菌落形成機關CFU(colonyformingunit)。
以同一稀釋菌液的OD600nm為橫坐标、CFU為縱坐标繪制标準曲線，如圖4所示，得到回歸方程式y=109x-9×106（R2=0.9974），用于後續計算C26菌液濃度。
為了檢驗菌株C26對動物腸道環境的耐受性，對其分别進行耐酸試驗和耐膽鹽試驗。
分别測定菌株C26室溫下在pH為3.5、4.5、5.5和6.5的LB（含2.5%NaCl）液體培養基中的生長狀況，結果如圖5所示。
在24h培養周期内，在pH6.5和pH5.5的培養基中培養的C26生長良好，菌液OD600nm呈上升趨勢，至8h穩定。
培養8h和24h，在pH6.5的培養基中C26菌液OD600nm均達到1.0左右，在pH5.5的培養基中C26菌液OD600nm均達到0.9至1.0之間。
而在pH3.5和pH4.5的培養基中，C26生長受到抑制，24h培養周期内菌液OD600nm維持在初始值，未見增長。
結果表明，菌株C26在pH不低于5.5的酸性環境中生長良好，在pH低于4.5時生長受到抑制。
測定菌株C26室溫下在含膽鹽品質濃度為0、0.1、0.3、0.5g/100mL的LB（pH8.0，含2.5%NaCl）液體培養基中的生長狀況，結果如圖6所示。
24h培養周期内，空白對照組（不含膽鹽）菌液OD600nm整體呈上升趨勢，在培養4h後顯著增長，至8h和24h分别達到0.48±0.10和0.73±0.05。
在含0.1g/100mL膽鹽的培養基中，菌液OD600nm呈現增長（2h）、下降（4h）、再增長（8h，24h）的變化趨勢，2h和4h的數值分别為0.16±0.02和0.12±0.02，至8h達到0.39±0.06，至24h為0.48±0.05，其峰值顯著低于空白對照組峰值（P＜0.05）。
在含0.3g/100mL和0.5g/100mL膽鹽的培養基中，菌液OD600nm也呈現增長（2h）、下降（4h）、再增長（8h，24h）的變化趨勢，24h峰值分别為0.16±0.04（含0.3g/100mL膽鹽）、0.13±0.04（含0.5g/100mL膽鹽），顯著低于空白對照組和含低濃度膽鹽組。
結果表明，膽鹽在0.1g/100mL的濃度即可抑制菌株C26的生長，在高于0.3g/100mL的濃度能極顯著抑制菌株C26的生長。
為檢驗菌株C26對蛤仔的安全性，選取蛤仔幼貝為試驗對象，采用菌液浸浴法進行攻毒試驗，試驗周期為5d。
取C26對數生長期菌液，按細胞終濃度為5×107cfu/mL的劑量施加到攻毒試驗組，每兩天換水一次，每次換水時重新施加新鮮菌液，試驗周期内共計施加3次（0d，2d，4d）。
攻毒試驗結果如表2所示，兩組試驗組蛤仔幼貝的5d存活率均為93%，而兩組對照組蛤仔幼貝的5d存活率分别為96%和95%，試驗組幼貝存活率略低于對照組，但均高于90%，據此推斷菌株C26在5×107cfu/mL的浸浴濃度下對蛤仔幼貝安全無毒，可作為潛在益生菌進行後續試驗。
為檢測菌株C26的抗生素敏感性，選取四環素類、β-内酰胺類、大環内酯類、氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、氯黴素類等七大類共計8種抗生素，分别測定菌株C26對這些抗生素的敏感性，結果如表3所示。
菌株C26對四環素、卡那黴素和頭孢氨苄耐受，對紅黴素和青黴素中度敏感，而對複方新諾明、諾氟沙星和氯黴素敏感。
菌株C26對蛤仔生長的影響結果如圖7所示。
空白對照組蛤仔幼貝的初始總重量為22.40±0.33g，試驗周期結束時總重量為（24.00±0.40）g，平均增重率為7.10%±0.71%。
試驗組蛤仔幼貝的初始總重量為（23.38±0.20）g，經60d浸浴試驗後總重量為（25.57±0.09）g，平均增重率為9.37%±0.53%。試驗組蛤仔幼貝增重率顯著高于對照組（P＜0.05）。
在養殖試驗周期内，對照組蛤仔幼貝日增殼長、日增殼高、日增殼寬分别為（14.68±1.02）µm/d、（11.96±1.01）µm/d和（10.47±0.45）µm/d，試驗組蛤仔幼貝日增殼長、日增殼高、日增殼寬分别為（15.01±0.47）µm/d、（11.99±0.94）µm/d和（11.10±0.50）µm/d。
與對照組相比，試驗組蛤仔殼規格日增值差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，菌株C26浸浴處理能顯著提高蛤仔幼貝增重率。
«——【·結語·】——»
從健康菲律賓蛤仔腸道中分離篩選獲得1株能夠産生澱粉酶、蛋白酶和脂肪酶的細菌C26，經鑒定該菌株為假交替單胞菌屬細菌。
結果表明菌株C26耐酸、耐膽鹽試驗結果表明，菌株C26在強酸和高濃度膽鹽的條件下，活菌數量未減少且仍呈上升趨勢，表明菌株C26具有較強的酸性耐受性和膽鹽耐受性。
結果表明蛤仔幼貝在菌株C26浸浴濃度高達5×107cfu/mL的條件下，5d存活率仍高于90%，表明菌株C26對蛤仔幼貝安全無毒。
為期60d的養殖試驗結束後，菌株C26處理組的增重率為9.37%±0.53%，相較于空白對照組7.10%±0.71%的增重率有顯著提高（P＜0.05），表明菌株C26對蛤仔幼貝的生長具有促進作用。