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周嘉良等
基金项目：江西省科技厅重点研发计划一般项目“井冈蜜柚轻简化无病毒良种苗木繁育技术研究与示范”（项目编号：20202BBFL63012）。
柑橘黄龙病是世界上最重要的检疫病害之一，起源于广州潮汕地区，20世纪初在华南地区首次报道。一段时间以来，黄龙病在大陆柑橘种植面积较大的地区暴发，严重影响着大陆柑橘产业的发展。国内外学者在20世纪60年代对黄龙病病原激烈讨论，起初，有学者认为其病因是病毒的侵染或是支原体等原核生物。直到20世纪，科学家们才在电子显微镜下观察到黄龙病的病原菌，之后黄龙病的病原性质才逐渐明确 。目前，最有效的获得脱毒苗的方法之一是茎尖微芽嫁接 ，但是在实际生产过程中也常常出现嫁接污染率高，萌发率较低等不稳定的情况，因此对于此技术最佳实验条件的探索是有意义的。
本文将针对微芽嫁接实验的最佳实验条件进行研究，即探索在不同季节采取金兰柚茎段，离体诱导幼芽以探索最佳的取材时间；采用不同大小的茎段离体培养，探索最佳移植体大小。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1砧木
用75%酒精处理于秋季（10月）采摘的枳壳成熟果实，对果实进行表面消毒并用保鲜袋装好，在试管中培养成为砧木黄化苗。
1.1.2嫁接材料
金兰柚茎段材料来源于江西省吉安市井冈山农业高新技术产业示范区的井冈蜜柚育种基地。直接将茎段消毒用于微芽嫁接试验的各项处理。
1.1.3茎段
各供试金兰柚树龄在3年以内，材料来自以上所述的金兰柚品种，外植体为以上成年态金兰柚茎段，大多当年生春、夏、秋梢。
1.1.4培养基
实验采用的植物生长调节剂为6-BA；其他培养基所需物质为蔗糖、琼脂。MT培养基、MS培养基所需各种微量或大量元素。
1.2研究方法
1.2.1砧木黄化苗的培养
首先从成熟的枳壳果实中剥取饱满的种子，用75%酒精充分的浸泡枳壳种子1min，并用无菌水仔细地冲洗3次，然后在灭菌玻璃皿上将种子的内外种皮小心地剥除，用5%的次氯酸钠溶液对种子消毒5~10min，并用无菌水仔细地冲洗5次；确保处于处理环境为无菌条件，以固体培养基MT+蔗糖接种每一管枳壳种子。
标记好日期和处理方法，置于26℃±2℃的培养室中暗培养21天左右以便获得可以用于嫁接的黄化苗，于嫁接1至2天之前将黄化苗置于培养室内光照下，锻炼为嫁接砧木。如果无须及时作为嫁接砧木使用，可置于4℃冰箱保存，在需要使用时再提前6小时放到培养室中进行温度锻炼。
1.2.2茎段消毒试验
金兰柚（Citrus maxima ‘Jinlan Yu’）茎段外表皮含有外生菌可以在合适的消毒处理下去除，但是内生菌，一般消毒方法难以杀死。为了解决早期培养中初代培养的成年态材料的这些问题，采用不同消毒的消毒剂搭配、消毒时间以及消毒组合等方法对茎段进行消毒实验，以期获得较好的消毒效果。
表1 不同季节、不同长度的茎段消毒试验设计
表2 不同季节茎段消毒实验结果
表3 不同大小茎段消毒实验结果
具体技术如下：选择优良母株，用含有2~3个腋芽的嫩梢切成5cm长的段，先用稀释的洗洁精溶液冲洗，再用流动的水冲洗30min，去除表面灰尘。在超净工作台上操作时用无菌水冲洗几次，放入无菌烧杯备用。在26℃±2℃，光周期16小时/日，光照强度2500lx的培养条件下进行培养。
（1）不同季节取材消毒的效果实验设计。
于3月至10月各月下旬，晴天上午9点左右，在井冈山农业高新技术产业示范区井冈蜜柚繁育基地井冈取3年以内生金兰柚（Citrus maxima ‘Jinlan Yu’）半木质化嫩梢，用5%NaClO灭菌10min，用无菌水冲洗3次，重复此操作一次，后接种于MT固体培养基中。每个处理的茎段数量为30个茎段，重复3次，观察并记录10天后嫁接苗的成活率，再计算30天后的成活率。
（2）不同外植体大小的消毒效果实验设计。
取金兰柚（Citrus maxima ‘Jinlan Yu’）5cm茎段，在超净工作台用75%酒精浸泡15秒后进行震荡，用5%NaClO灭菌20min（分两次，每次10min），消毒期间不停震荡，使消毒剂与外植体充分结合，用无菌水各冲洗3次。将经过处理后的茎段分别剪成1cm、2cm、3cm、4cm、5cm。接种于MT+6-BA（1.0mg/L+40g/L）的蔗糖培养基上诱导茎段产生不定芽萌发。每个处理的茎段数量为20个茎段，重复三次，5天后开始观察，10天后统计污染率，30天后统计相关生长情况。
2 结果与分析
2.1 不同季节茎段消毒效果结果如表2所示。
2.2不同长度茎段消毒实验结果如表3所示。
2.3不同季节茎段消毒污染率与萌发率对比
于3月至10月各月下旬，晴天的上午9点左右取3年以内生的茎段消毒处理。根据图2实验结果表明：不同月份取材对茎段的污染率和萌芽率有很明显的影响，5月下旬获得的污染率最低，为23.33%左右，萌发率最高，约为73.33%；而10月下旬污染率最高约为72.22%，且萌发率最低，仅18.89%同时可以分析3~5月份有较低的污染率和较高的萌发率，7~10月份则效果较差（见图1）。
图1 不同季节茎段消毒实验对比
图2 不同茎段大小消毒实验对比
2.4不同大小茎段消毒污染率与萌芽率对比
根据图2表明：茎段长度1~2cm时污染率为40.00%最低，其中2cm茎段萌发率35.00%最高，其余茎段长度污染率均高于1~2cm茎段，且萌发率明显低于采用2cm茎段。
依据实验数据可知选择不同季节、不同大小的茎段作为离体诱导幼芽的材料对于移植体的污染率和萌发率有明显影响；同时，外植体消毒方式的选择也对消毒效果有很大的影响。
取5 月份下旬的嫩梢茎段，用5%NaClO灭菌10min，用无菌水冲洗3次，再用5%NaClO灭菌10min，用无菌水冲洗3次，接种于MT固体培养基中。其中，5月份是判定木材采伐期的最佳时间，5月份的污染率最低，为23.33%，发芽率最高，为71.11%。分析其原因可能是3月份温度较低，初春时期春梢长势不佳，接穗虽然有部分存活，但是分裂分化能力较弱7月份夏梢，由于温度升高，空气中的细菌浓度上升，导致新生枝条表面细菌增加，消毒困难。
将外植体茎段分别切成1cm、2cm、3cm、4cm、5cm，不改变其他培养条件，所得结果表明长度1~2cm茎段污染率最低，约为40.00%，其中2cm茎段萌发率最高，约为35.00%。分析原因是茎段的大小与其所带的细菌数成正比，即茎段越长所带细菌数量越多，因此，消毒效果越差，反之亦然。而1cm茎段的萌发率低，可能原因是茎段过短，吸收营养不足所导致。
3 结论
根据实验数据的分析和讨论，采用5月下旬外植体茎段进行离体诱导所得结果污染率较低，采用2cm茎段效果最好。