近日，考虑到全球替代蛋白、生物多糖原料等必需品的供需紧张，西安交通大学费强教授和团队提出了利用嗜甲烷菌转化甲烷气体从而合成生物大分子的新范式。
图 | 费强（来源：费强）
在开发这项新技术的时候，他们发现有两个关键科学技术制约了该项技术的发展：一是菌种的细胞代谢调控机制尚不清晰；二是目标产品的定向合成策略不健全。
针对上述难点，他们围绕选育天然菌株和改造模式菌株这两个技术路线，针对嗜甲烷菌细胞工厂，开发了可以高效合成细胞蛋白质和多糖聚合物的高密度发酵技术。
其中，菌体干重超过 14 克/升，蛋白质时空生产效率接近 20 克/升/天，蛋白质含量超过 70%，生物多糖含量超过 30%，上述生物固碳能力和产品转化效率等指标均处于国际先进水平。
而随着本次技术的优化和改良，上述生产数据有望在短时间内进一步提高 25%。
在解决生产瓶颈的同时，他们深入解析了细胞工厂中碳氮代谢流的协同适配机制。
通过引入基于氮-氧营养的可控性诱导策略，强化了目标产物的人工定向合成，显著提升了蛋白质和生物多糖的生产效率，实现了从一碳分子到生物大分子的一步转化。
（来源：Green Chemistry）
总的来说，本次开发的甲烷蛋白制备技术为大陆粮食安全和“耕地红线”的保障提供了切实可行的方案。
费强表示，本次产出的甲烷蛋白粗蛋白质含量超过 70%，富含亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸等必需氨基酸，全部 18 种氨基酸占蛋白质比例超过 85%，为单纯蛋白质类型。
甲烷蛋白结构比例接近鱼粉，远优于豆粕，可用于平替现有的蛋白饲料。
以工业化生产 1000 万吨甲烷蛋白（蛋白含量 70%）计，相当于 2300 万吨进口大豆（蛋白含量 30%）当量。
与种植大豆相比，生产甲烷蛋白能够节约超过 500 倍的耕地和 3000 倍的淡水资源，不仅无需施用大量化肥和农药，还不受季节和气候等因素影响。
此外，通过本次开发的高密度发酵技术，可实现定向联产胞内多糖和胞外多糖等生物大分子组分。
经检测，该胞内多糖结构和支链淀粉高度相似，具有良好的生物相容性和降解性，可用作医药薄膜和水凝胶。胞外多糖则可作为医美产品的稳定剂、乳化剂和伤口敷料等。
由此可见，利用页岩气、煤层气或沼气制备生物大分子，不但可以提升甲烷的碳素附加值，还能实现高效的生物储能和汇碳，为新质生产力发展提供了全新策略。
“向微生物要蛋白”
据介绍，作为第二大温室气体，甲烷的 20 年周期温室效应是二氧化碳的 80 余倍。甲烷气体来源广泛，除了人们熟知的天然气和页岩气资源，煤层气和沼气也是主要的甲烷气源。
2015 年，美国凭借先进的页岩气开采技术，实现了从天然气进口国转变为天然气纯出国口。
大陆作为世界页岩气已探明储量第一的国家，2020 年页岩气开采量位居世界第二，而随着国家发展改革委和国家能源局联合发布《“十四五”现代能源体系规划》，预示着大陆的页岩气产量和开发力度有望实现新的突破。
页岩气中甲烷含量超过 95%，而作为低密度、高热能气体，页岩气的高值开发和高效储存，也成为大陆页岩气利用技术发展的焦点。
此外，因为受限沼气盈利模式差，沼气工程难以推广，从而导致农林有机废碳资源利用不足。
目前，甲烷主要用于燃烧产热电，利用方式较为单一、附加值较低。而且，甲烷中碳素在燃烧过程中全部转化为二氧化碳，造成碳排放和碳资源浪费，碳原子经济性很低。
随着“双碳”目标的提出，大陆十分重视甲烷的减排及利用技术的开发。一碳生物制造技术在实现甲烷高效固定同时，可以制备多种功能性生物基产品。
嗜甲烷菌是一类特殊的环境微生物，能够利用甲烷作为唯一碳源生长。因此，甲烷生物转化技术可在常温常压下自发进行，且有毒害副产物和二氧化碳排放较少。
另据悉，豆粕是最重要的养殖业饲用蛋白来源，而大陆大豆原料长期大量依赖进口，对外依存度超过 80%，这已成为大陆农业的最大短板之一。
在当前日益严峻且复杂多变的国际形势下，大豆供应形势的不容乐观，严重危及着国家发展和经济安全。
微生物蛋白的生物制造，已成为解决蛋白资源紧缺的主要途径之一，而大陆相关部门也多次提出“向微生物要蛋白”的需求。
目前，欧盟已经批准微生物蛋白质用于饲料添加剂，美国 Calysta 和丹麦 Unibio 等科技公司也着手研发放大生产技术，并相继取得了可观的进展。
但是，全球主流的微生物蛋白核心生产技术和生产菌种仍被欧美国企业所掌握，间接制约了大陆的自主技术发展。
菌种：生物制造领域的“芯片”
几年前，欧美国家的顶尖高校已经在甲烷生物利用方面积累了多年的研究成果和宝贵经验，而国内研究极少，亟需得到突破。
作为西安交通大学生物化工学术带头人，费强长期围绕生物制造原料的开发与高效利用开展相关前沿科技攻关。
针对甲烷气体利用方式单一、产品附加值低的问题，2017 年费强带领课题组成员，开发了以甲烷为原料的一碳生物转化技术。
考虑到全球人口增长和人们生活水平日益提高，而传统的动植物蛋白产能已经达到上限，未来将出现蛋白供不应求的局面，因此他们选择细胞蛋白质作为主要产品之一来开展课题设计。
在确定好课题以后，他们围绕生物制造的核心要素（微生物菌种和高密度发酵技术）开展研发。
菌种是生物制造领域的“芯片”，其很大程度上决定了产能和产品质量，而大陆在工业菌株研发和保藏方面实力较弱，仍处于追赶国外先进水平的阶段。
没有自主知识产权的菌种，很难形成核心竞争力，日后容易在关键时刻被“卡脖子”。
2017 年在陕西省重点研发计划项目的支持下，费强多次带领课题组成员前往陕西各类湿地环境收集样本。
在经过上百次的菌种选育和鉴定，最终在秦岭山下水稻田和牛背梁等地样品中获得了十余株嗜甲烷菌种。
其具有生长速率快、抗逆性强等优势性状，并能够天然合成优良蛋白质、活性多糖、天然产物等高附加值产品，其中部分产品的生产方法获得国家专利发明并完成了成果转化。
2019 年，费强作为项目骨干，得到了国家重点研发计划“合成生物学”重点专项支持，借助生物合成等前沿技术深入挖掘了微生物体内的关键功能基因和代谢调控机制，完善了遗传改造工具和人工细胞构建方法。
通过对关键机制机理的全面探究和解析，他们成功建立了一整套以嗜甲烷菌细胞工厂为中心的甲烷生物制造平台技术，实现了利用基因工程菌生物合成包括精细化学品、生物材料、药物中间体等高值产品。
在长期的累积后，2021 年费强作为项目负责人和首席科学家获得了国家重点研发计划“绿色生物制造”重点专项的支持。
团队成员通过完成数千批摇瓶实验，从头搭建了多种培养体系，验证了气源组分、培养基成分及浓度对菌种的影响，实现了甲烷和沼气的高效生物转化利用。
在过去的 3 年中，课题组历经了上百批次的发酵实验，成功开发了针对嗜甲烷菌的高密度发酵工艺和策略。
期间，他们完成了从 0.3L 到 30L 的生物反应系统攻坚，实现了实验室级别的 100 倍放大，最终创建了针对不同目标产物的嗜甲烷菌高密度发酵工艺。
值得一提的是，虽然他们在本次论文中提及的发酵工作所占篇幅很少，但背后隐藏着几十批“不理想”的发酵实验引导他们总结经验。
最终，他们不仅获得了最优工艺，还系统性总结了嗜甲烷菌蛋白和多糖的合成机制，首次提出了基于营养调控策略诱导生物大分子合成的新策略。
2023 年，他们又与大型沼气生产平台合作，探索了 100L 生物反应系统的连续高密度发酵工艺，初步验证了该工艺放大的可靠性，为实现甲烷蛋白的产业化生产奠定了坚实的基础。
努力确保甲烷生物制造全套工艺和设备的自主产权
事实上，在菌株筛选和工艺优化期间，他们遇到了很多困难，课题一度停滞不前，学生们的信心和积极性多次大幅受挫，大家的心态也经常波折起伏。
由于缺乏适配气体碳源的高通量选育系统，嗜甲烷菌筛选过程耗时费力，时常需要准备大量的消耗品。
自然环境中嗜甲烷菌常与其他微生物协同生长，彼此之间存在较强的互作依赖关系，分离获得单株嗜甲烷菌极为困难。
费强印象最深的是，有一名硕士研究生历时一年好不容易筛选到了可能富含类胡萝卜素的嗜甲烷菌，但可能因为保藏时染菌，经过二十轮筛分还是没能获得单一菌株，最后只得被迫放弃纯化，转而以混菌体系进行研究。
不仅如此，嗜甲烷菌的发酵工艺优化也是一波三折。甲烷是气态碳源，且溶解度极低，气液传质速率是嗜甲烷菌生长的主要限制因素。
发酵罐体系与摇瓶体系的气液传质速率相差太大，导致他们在摇瓶体系摸索发酵条件时困难重重，而且效率低下。
一开始，他们沿用大肠杆菌等模式菌株发酵优化研究，主要对培养基组分浓度、温度和酸碱度等条件进行单因素和响应面优化，但收效甚微。一名博士研究生在接手该部分工作后，曾有近一年半未取得任何实质性进展。
另一方面，费强认为正是嗜甲烷菌研究特有的挑战性，驱动他们团队不断创新和坚持做原创性研究。
本次研究中，他们遇到的一些问题很难在其他微生物的相关研究中找到参考解决方案。这倒逼他们追根溯源，深入挖掘嗜甲烷菌独特的代谢调控机制。
最典型的案例是，在模式菌株中常用的分批补料发酵不仅未能提高嗜甲烷菌细胞密度，反而导致蛋白产率下降。
起初他们百思不得其解，借助转录组学手段他们发现该工艺后期细胞处于营养失衡状态而生长停滞，碳流被用于合成胞外多糖。
这一发现使他们转向开发连续发酵工艺提高蛋白生产效率，并引导他们开始思考是否可能存在某种未知机制，从而控制嗜甲烷菌合成蛋白和多糖。
最终，相关论文以《嗜甲烷菌生物合成可食用产品的可控性诱导新策略》（A novel nutritional induction strategy flexibly switching the biosynthesis of food-like products from methane by a methanotrophic bacterium）为题发在 Green Chemistry[1]。
博士研究生高子熹是第一作者，费强教授担任第一单位通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Green Chemistry）
由于这项开创性工作对于替代蛋白和生物多糖功能的开发具有重大意义。鉴于此，本次论文也被 Green Chemistry 邀请作为封页论文发表。
但是，课题组希望不仅仅是发展一个“实验室技术”，而且非常关注技术的产业化落地，希望这个技术能够真正发挥其价值。
目前，他们已经与有着丰富发酵工程化经验的公司展开合作，推进技术的工程化放大。
同时，也与页岩气资源丰富的地方政府和产业上下游企业开展了卓有成效的工作，为产业化储备了丰富的资源。
而作为大陆首个以甲烷为原料开发嗜甲烷菌生物制造技术的科研团队，后续他们将继续围绕嗜甲烷菌的物质代谢和能量代谢进行精准耦合调控。
通过强化细胞内碳-氮代谢的互作关系，实现特定氨基酸的定向合成，从分子水平上提升甲烷生物转化效率和目标产品的生产效率。
鉴于生物合成多糖在食品、医疗、环境、材料等领域具有广泛的市场空间，他们也将针对甲烷多糖在医美原料和农用菌肥方面的应用，进一步开展理化和生物活性的功效实验。
为了适应工业化生产，他们将首先聚焦开发具有较高气液传质速率的新型生物反应系统，以适配利用不同甲烷气源进行嗜甲烷菌高密度发酵和目标产品生产工艺，为确保甲烷生物制造全套生产工艺和设备具有自主知识产权。
不久之后，他们将根据不同甲烷气源进行全工业条件下的连续化中试生产验证，选址包括页岩气基地、畜禽养殖场和天然气尾矿等，从而展现甲烷蛋白或多糖的规模化生产及其碳减排潜力。
参考资料：
1.Gao, Z., Guo, S., Chen, Y., Chen, H., Fu, R., Song, Q., ... & Fei, Q. (2024). A novel nutritional induction strategy flexibly switching biosynthesis of food-like products from methane by a methanotrophic bacterium.Green Chemistry.
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