文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
类钙调磷酸酶B亚基蛋白是植物体内的钙离子感受器之一，其可以与CBL互作蛋白激酶特异性结合，形成的CBL-CIPK复合体在植物生长发育和响应逆境胁迫方面发挥着关键作用。
本次在豌豆全基因组范围内共鉴定出13个PsCBLs和20个PsCIPKs，它们均分布在除3号染色体外的其余6条染色体中。
除了PsCBL5的序列长度为416aa之外，其余的PsCBLs均是由200多个氨基酸组成的短肽段，PsCIPKs蛋白序列长度均在450aa左右。
也除PsCIPK18外，其余PsCIPKs和PsCBLs的启动子区域均含响应激素和逆境胁迫相关的顺式作用元件，且响应脱落酸信号的顺式作用元件最多。
钙离子在植物基因中的作用
钙离子在植物逆境信号转导过程中起重要作用。
当植物受到干旱、高温、高盐和低温等非生物胁迫时，细胞内的钙离子浓度会发生变化，产生的钙离子信号被钙离子感受器接收，然后引起一系列的生理生化反应。
CBL蛋白是植物体内的钙离子感受器之一，它通常含有4个EF手结构域和一个PFPF结构域，EF手结构域可结合植物体内的钙离子。
C端的PFPF结构域可与丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶上的NAF、FISL结构域结合，CBL蛋白和丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶在相互作用形成丝氨酸、苏氨酸磷酸酶复合体后才可对钙离子信号进行转导，进而通过调控下游靶标基因的表达来响应非生物胁迫。
CIPK是植物中特有的一类含有丝氨酸、苏氨酸功能域的蛋白激酶，它的N端含有一个保守的Pkinase结构域，主要起催化激活作用。
而C端含有NAF、FISL结构域和PPI结构域，用来结合CBL蛋白；另外，PPI结构域也可被磷酸酶结合，进而参与激素信号转导途径和调控细胞生命活动。
目前，在拟南芥、水稻和油菜等植物中CBL和CIPK蛋白已被鉴定分析。结果表明，每个CBL蛋白可与多个CIPK蛋白互作，一个CIPK蛋白也可与多个CBL蛋白互作。
它们互作后形成的CBL-CIPK蛋白复合体可响应高盐、干旱、低温、脱落酸、低钾和高pH值等非生物胁迫。
研究表明，在植物受到高盐和干旱胁迫时，胞外的高浓度的钠离子可诱导胞内钙离子的浓度升高、钾离子浓度降低。
AtCBL10-AtCIPK24、SOS2复合体在接收钙离子信号后可通过液泡维持胞内的钠离子浓度，减少钠离子的流入。
另外，在植物受到高盐和干旱胁迫时，大量钠离子的流入会使胞内的大量钾离子发生外流。
AtCBL1、9-AtCIPK23复合体接收钙离子信号后，可通过调节钾离子通道增加钾离子内流，增加胞内钾离子浓度，进而维持植物细胞的生命活动。
目前，响应逆境胁迫的CBL和CIPK基因家族在豌豆中还未报道，本研究对豌豆中的PsCBLs和PsCIPKs在全基因组水平上进行鉴定和分析，并分析了其在干旱胁迫下的转录水平。
这将有助于研究PsCBLs和PsCIPKs在豌豆中响应干旱等逆境胁迫的分子机理，为筛选豌豆抗逆基因进行分子标记辅助选择育种提供了可能。
豌豆CBL、CIPK基因家族的鉴定
从豌豆基因组中共鉴定出13个CBL基因和20个CIPK基因，根据它们在染色体上的排列顺序分别命名为PsCBL1~PsCBL13和PsCIPK1~PsCIPK20。
它们分别分布于豌豆1号、2号、4号、5号、6号、7号染色体上，但PsCBLs和PsCIPKs在3号染色体上均未分布。
在PsCBLs中，蛋白质长度范围在213aa~416aa之间，分子量范围24437.04Da~44549.15Da，等电点范围4.5~4.93。
通过对基因比对覆盖率和氨基酸一致性均大于80%的标准进行筛选，发现了一个复制基因对，这可能是串联拷贝产生的。
此外，共线性分析显示，PsCBL和PsCIPK在不同染色体上均有基因彼此共线，如PsCBL1和PsCBL4、PsCBL2和PsCBL10、PsCBL3和PsCBL6、PsCIPK3和PsCIPK19。
这些结果表明，CBL基因家族和CIPK基因家族在豌豆中的扩增可能是由整个或小规模基因组的串联重复而来。
为研究豌豆与其它物种中CBL、CIPK基因家族成员的进化关系。
本研究采用MEGA软件中的最大似然法对拟南芥中的10个AtCBLs、水稻中的10个OsCBLs和从豌豆中鉴定到的13个PsCBLs的蛋白序列进行系统进化树分析。
结果表明，AtCBLs、OsCBLs和PsCBLs蛋白可被归为4组，除了GroupI中仅有AtCBL5和PsCBL13外，拟南芥、水稻和豌豆中的CBL在其它三组中均有分布。
其中成共线的PsCBL3和PsCBL6分布在GroupⅢ中，成共线的PsCBL1和PsCBL4、PsCBL2和PsCBL10均分布在GroupⅣ中。
同时，利用鉴定的20个PsCIPKs蛋白序列、已报道的26个拟南芥AtCIPKs和33个水稻OsCIPKs的蛋白序列，采用同样的方法构建系统发育进化树。
结果表明，AtCIPKs、OsCIPKs和PsCIPKs蛋白也可被归为4组，拟南芥、水稻和豌豆中的CIPK在这四组中均有分布，其中GroupⅢ和GroupⅣ中的CIPK蛋白最多。
而GroupⅡ中的CIPK蛋白最少，且豌豆中仅有成共线性的PsCIPK3和PsCIPK19分布在其中。
豌豆PsCBLs的系统进化树分析表明，PsCBL3、PsCBL5和PsCBL6的亲缘关系较近，聚为一类，其余的PsCBLs聚为一类。
motif预测分析表明除了PsCBL5不含motif5之外，其余的PsCBLs都含有5个保守motif。保守结构域分析表明，13个PsCBLs均含有EF-hand_7保守结构域。
豌豆CBL、CIPK基因的表达模式分析
为了研究豌豆PsCBLs、PsCIPKs的组成性表达模式，本研究用TBtools软件对PsCBLs和PsCIPKs在“中豌6号”不同组织部位的表达量进行可视化分析。
结果表明，在豌豆PsCBLs中，PsCBL2、4、10在这6个组织中的表达量均比较高，且均在豌豆须中最高表达；而PsCBL3在豌豆花蕾和花中特异高表达。
总的来看，大多数豌豆PsCBLs、PsCIPKs基因在豌豆须、花蕾和花中特异性高表达，表明这些基因很可能在豌豆的生长发育和生殖发育方面发挥重要作用。
为研究在干旱胁迫下PsCBL-CIPKs的表达模式，本研究以豌豆耐旱种质和干旱敏感种质为材料，分析在干旱胁迫下，PsCBL-CIPKs在两种质幼苗期和成熟期叶片中的表达模式。
结果表明，在不同时期不同处理的两个种质叶片中，PsCBL2、4、10、PsCIPK5、12的表达量较高。
显著差异性分析结果表明，干旱胁迫下耐旱种质成熟期叶片中PsCBL2的表达量显著下降，而PsCIPK11、19的表达量显著升高。
但在幼苗期和干旱敏感种质不同时期的叶片中这3个基因的表达水平差异均不显著。
干旱胁迫下耐旱种质幼苗期叶片中PsCBL6、11的表达量显著下降，而PsCIPK7的表达量显著升高，在成熟期和干旱敏感种质不同时期的叶片中这3个基因的表达水平差异均不显著。
耐旱种质成熟期和干旱敏感种质幼苗期的叶片中，PsCBL8和PsCIPK1在干旱胁迫下表达量显著下降。
而PsCIPK8、17在干旱胁迫下表达量显著升高，但这4个基因在耐旱种质幼苗期和干旱敏感种质成熟期叶片中的表达水平差异均不显著。
干旱胁迫下，PsCIPK10在耐旱种质和干旱敏感种质的成熟期叶片中的表达量均显著下降，但在幼苗期差异不显著。
PsCBL2、6、11和PsCPK7、11、19只在耐旱种质中呈显著性差异，在干旱敏感种质中差异不显著。
其中，PsCBL2、6、11和PsCPK11、19的表达量在干旱胁迫下得到显著性下调，PsCPK7的表达量在干旱胁迫下得到显著性上调。
总的来看，在干旱胁迫下，PsCBL2、6、8、11、12、13和PsCIPK1、6、10、18在不同种质不同时期叶片中的表达趋势一致，均比对照的表达水平低。
这就表明干旱胁迫抑制了叶片中这些基因的表达，这些基因可能通过形成复合体的来响应干旱胁迫；而PsCIPK2、7、8、11、17、20在干旱胁迫下表达量多呈上升趋势。
同时也说明干旱胁迫促进了叶片中这些基因的表达，这些基因可能是响应干旱胁迫的正调控因子。
干旱敏感种质中在干旱胁迫下呈显著性差异的PsCBL-CIPKs基因比耐旱种质中的多，且多呈显著性降低，可能PsCBL-CIPKs基因在干旱敏感种质中更容易响应干旱胁迫。
在植物中，CBLs与CIPKs相互作用可以调节植物生长发育和响应生物胁迫以及响应高盐、寒冷、干旱、pH、激素等非生物胁迫。
本次从豌豆全基因组范围内共鉴定到13个PsCBLs和20个PsCIPKs，对其进行了理化性质和系统进化树分析，并分析了其在不同组织以及干旱胁迫下的表达模式。