文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
類鈣調磷酸酶B亞基蛋白是植物體内的鈣離子感受器之一，其可以與CBL互作蛋白激酶特異性結合，形成的CBL-CIPK複合體在植物生長發育和響應逆境脅迫方面發揮着關鍵作用。
本次在豌豆全基因組範圍内共鑒定出13個PsCBLs和20個PsCIPKs，它們均分布在除3号染色體外的其餘6條染色體中。
除了PsCBL5的序列長度為416aa之外，其餘的PsCBLs均是由200多個氨基酸組成的短肽段，PsCIPKs蛋白序列長度均在450aa左右。
也除PsCIPK18外，其餘PsCIPKs和PsCBLs的啟動子區域均含響應激素和逆境脅迫相關的順式作用元件，且響應脫落酸信号的順式作用元件最多。
鈣離子在植物基因中的作用
鈣離子在植物逆境信号轉導過程中起重要作用。
當植物受到幹旱、高溫、高鹽和低溫等非生物脅迫時，細胞内的鈣離子濃度會發生變化，産生的鈣離子信号被鈣離子感受器接收，然後引起一系列的生理生化反應。
CBL蛋白是植物體内的鈣離子感受器之一，它通常含有4個EF手結構域和一個PFPF結構域，EF手結構域可結合植物體内的鈣離子。
C端的PFPF結構域可與絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶上的NAF、FISL結構域結合，CBL蛋白和絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶在互相作用形成絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶複合體後才可對鈣離子信号進行轉導，進而通過調控下遊靶标基因的表達來響應非生物脅迫。
CIPK是植物中特有的一類含有絲氨酸、蘇氨酸功能域的蛋白激酶，它的N端含有一個保守的Pkinase結構域，主要起催化激活作用。
而C端含有NAF、FISL結構域和PPI結構域，用來結合CBL蛋白；另外，PPI結構域也可被磷酸酶結合，進而參與激素信号轉導途徑和調控細胞生命活動。
目前，在拟南芥、水稻和油菜等植物中CBL和CIPK蛋白已被鑒定分析。結果表明，每個CBL蛋白可與多個CIPK蛋白互作，一個CIPK蛋白也可與多個CBL蛋白互作。
它們互作後形成的CBL-CIPK蛋白複合體可響應高鹽、幹旱、低溫、脫落酸、低鉀和高pH值等非生物脅迫。
研究表明，在植物受到高鹽和幹旱脅迫時，胞外的高濃度的鈉離子可誘導胞内鈣離子的濃度升高、鉀離子濃度降低。
AtCBL10-AtCIPK24、SOS2複合體在接收鈣離子信号後可通過液泡維持胞内的鈉離子濃度，減少鈉離子的流入。
另外，在植物受到高鹽和幹旱脅迫時，大量鈉離子的流入會使胞内的大量鉀離子發生外流。
AtCBL1、9-AtCIPK23複合體接收鈣離子信号後，可通過調節鉀離子通道增加鉀離子内流，增加胞内鉀離子濃度，進而維持植物細胞的生命活動。
目前，響應逆境脅迫的CBL和CIPK基因家族在豌豆中還未報道，本研究對豌豆中的PsCBLs和PsCIPKs在全基因組水準上進行鑒定和分析，并分析了其在幹旱脅迫下的轉錄水準。
這将有助于研究PsCBLs和PsCIPKs在豌豆中響應幹旱等逆境脅迫的分子機理，為篩選豌豆抗逆基因進行分子标記輔助選擇育種提供了可能。
豌豆CBL、CIPK基因家族的鑒定
從豌豆基因組中共鑒定出13個CBL基因和20個CIPK基因，根據它們在染色體上的排列順序分别命名為PsCBL1~PsCBL13和PsCIPK1~PsCIPK20。
它們分别分布于豌豆1号、2号、4号、5号、6号、7号染色體上，但PsCBLs和PsCIPKs在3号染色體上均未分布。
在PsCBLs中，蛋白質長度範圍在213aa~416aa之間，分子量範圍24437.04Da~44549.15Da，等電點範圍4.5~4.93。
通過對基因比對覆寫率和氨基酸一緻性均大于80%的标準進行篩選，發現了一個複制基因對，這可能是串聯拷貝産生的。
此外，共線性分析顯示，PsCBL和PsCIPK在不同染色體上均有基因彼此共線，如PsCBL1和PsCBL4、PsCBL2和PsCBL10、PsCBL3和PsCBL6、PsCIPK3和PsCIPK19。
這些結果表明，CBL基因家族和CIPK基因家族在豌豆中的擴增可能是由整個或小規模基因組的串聯重複而來。
為研究豌豆與其它物種中CBL、CIPK基因家族成員的進化關系。
本研究采用MEGA軟體中的最大似然法對拟南芥中的10個AtCBLs、水稻中的10個OsCBLs和從豌豆中鑒定到的13個PsCBLs的蛋白序列進行系統進化樹分析。
結果表明，AtCBLs、OsCBLs和PsCBLs蛋白可被歸為4組，除了GroupI中僅有AtCBL5和PsCBL13外，拟南芥、水稻和豌豆中的CBL在其它三組中均有分布。
其中成共線的PsCBL3和PsCBL6分布在GroupⅢ中，成共線的PsCBL1和PsCBL4、PsCBL2和PsCBL10均分布在GroupⅣ中。
同時，利用鑒定的20個PsCIPKs蛋白序列、已報道的26個拟南芥AtCIPKs和33個水稻OsCIPKs的蛋白序列，采用同樣的方法建構系統發育進化樹。
結果表明，AtCIPKs、OsCIPKs和PsCIPKs蛋白也可被歸為4組，拟南芥、水稻和豌豆中的CIPK在這四組中均有分布，其中GroupⅢ和GroupⅣ中的CIPK蛋白最多。
而GroupⅡ中的CIPK蛋白最少，且豌豆中僅有成共線性的PsCIPK3和PsCIPK19分布在其中。
豌豆PsCBLs的系統進化樹分析表明，PsCBL3、PsCBL5和PsCBL6的親緣關系較近，聚為一類，其餘的PsCBLs聚為一類。
motif預測分析表明除了PsCBL5不含motif5之外，其餘的PsCBLs都含有5個保守motif。保守結構域分析表明，13個PsCBLs均含有EF-hand_7保守結構域。
豌豆CBL、CIPK基因的表達模式分析
為了研究豌豆PsCBLs、PsCIPKs的組成性表達模式，本研究用TBtools軟體對PsCBLs和PsCIPKs在“中豌6号”不同組織部位的表達量進行可視化分析。
結果表明，在豌豆PsCBLs中，PsCBL2、4、10在這6個組織中的表達量均比較高，且均在豌豆須中最高表達；而PsCBL3在豌豆花蕾和花中特異高表達。
總的來看，大多數豌豆PsCBLs、PsCIPKs基因在豌豆須、花蕾和花中特異性高表達，表明這些基因很可能在豌豆的生長發育和生殖發育方面發揮重要作用。
為研究在幹旱脅迫下PsCBL-CIPKs的表達模式，本研究以豌豆耐旱種質和幹旱敏感種質為材料，分析在幹旱脅迫下，PsCBL-CIPKs在兩種質幼苗期和成熟期葉片中的表達模式。
結果表明，在不同時期不同處理的兩個種質葉片中，PsCBL2、4、10、PsCIPK5、12的表達量較高。
顯著差異性分析結果表明，幹旱脅迫下耐旱種質成熟期葉片中PsCBL2的表達量顯著下降，而PsCIPK11、19的表達量顯著升高。
但在幼苗期和幹旱敏感種質不同時期的葉片中這3個基因的表達水準差異均不顯著。
幹旱脅迫下耐旱種質幼苗期葉片中PsCBL6、11的表達量顯著下降，而PsCIPK7的表達量顯著升高，在成熟期和幹旱敏感種質不同時期的葉片中這3個基因的表達水準差異均不顯著。
耐旱種質成熟期和幹旱敏感種質幼苗期的葉片中，PsCBL8和PsCIPK1在幹旱脅迫下表達量顯著下降。
而PsCIPK8、17在幹旱脅迫下表達量顯著升高，但這4個基因在耐旱種質幼苗期和幹旱敏感種質成熟期葉片中的表達水準差異均不顯著。
幹旱脅迫下，PsCIPK10在耐旱種質和幹旱敏感種質的成熟期葉片中的表達量均顯著下降，但在幼苗期差異不顯著。
PsCBL2、6、11和PsCPK7、11、19隻在耐旱種質中呈顯著性差異，在幹旱敏感種質中差異不顯著。
其中，PsCBL2、6、11和PsCPK11、19的表達量在幹旱脅迫下得到顯著性下調，PsCPK7的表達量在幹旱脅迫下得到顯著性上調。
總的來看，在幹旱脅迫下，PsCBL2、6、8、11、12、13和PsCIPK1、6、10、18在不同種質不同時期葉片中的表達趨勢一緻，均比對照的表達水準低。
這就表明幹旱脅迫抑制了葉片中這些基因的表達，這些基因可能通過形成複合體的來響應幹旱脅迫；而PsCIPK2、7、8、11、17、20在幹旱脅迫下表達量多呈上升趨勢。
同時也說明幹旱脅迫促進了葉片中這些基因的表達，這些基因可能是響應幹旱脅迫的正調控因子。
幹旱敏感種質中在幹旱脅迫下呈顯著性差異的PsCBL-CIPKs基因比耐旱種質中的多，且多呈顯著性降低，可能PsCBL-CIPKs基因在幹旱敏感種質中更容易響應幹旱脅迫。
在植物中，CBLs與CIPKs互相作用可以調節植物生長發育和響應生物脅迫以及響應高鹽、寒冷、幹旱、pH、激素等非生物脅迫。
本次從豌豆全基因組範圍内共鑒定到13個PsCBLs和20個PsCIPKs，對其進行了理化性質和系統進化樹分析，并分析了其在不同組織以及幹旱脅迫下的表達模式。