文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
本次对4个品种的紫云英开展了重测序，基于测序结果开发了15对多态性较好的SSR引物。
这15对SSR引物共扩增出等位基因52个，每对引物扩增出的平均有效等位基因数为2.69，平均多态性信息含量为0.50。
利用这15对SSR引物对103份紫云英种质资源的遗传多样性进行分析并绘制聚类图。
在遗传相似性系数为0.88时，可将所有的紫云英种质资源分成3类，其拟合共相关系数为0.64，表明结果真实可靠。
紫云英ISSR分析和分子标记技术
分子标记是植物遗传多样性研究的重要手段，较为常用的分子标记方法包括限制性扩增片段长度多态性、随机扩增多态性、扩增片段长度多态性、相关序列扩增多态性、简单重复序列、单核苷酸多态性等。
简单重复序列又可称为SSR标记，已广泛应用于各种农作物、园艺植物和草类植物的遗传多样性分析。
其原理是根据微卫星序列两端保守性强的序列设计特异引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。
由于核心序列串联重复数目不同，因而PCR产物的长度也不同，每一扩增位点就代表这一位点的一对等位基因，由于SSR重复数目变化很大，可揭示多态性高。
以分子标记技术为基础建立的指纹图谱技术，具有鉴别速度快、结果可靠等特点，已广泛应用于品种鉴定与亲缘关系研究。
紫云英是豆科黄芪属越年生植物，作为中国南方水稻冬闲田最主要的绿肥作物，翻压还田后大量茎叶和根茬腐解。
还可增加土壤腐殖质和全氮含量，活化和聚积矿质养分，发挥培肥改土的作用。此外，紫云英具有观赏、菜用等多种用途，是重要的蜜源和饲料作物。
中国是紫云英的起源地，是世界上种植和利用紫云英最早、栽培面积最大的国家。
新中国成立之前，紫云英种植于长江中下游地区及秦岭-淮河一线，野生资源主要分布在北纬33度左右。
在新中国成立后，国家推广绿肥种植，紫云英种植面积大规模发展，向北延伸至河南南部、江苏北部，向南延伸至两广地区，西至川渝地区，东至浙江、福建等东部沿海地区。
通过商业与文云英从中国传往东部邻国韩国与日本，在20世纪40年代，日本北部地区广泛种植紫云英作绿肥作物，南部邻国缅甸与越南也有紫云英引种的历史。
关于紫云英种质资源遗传多样性的相关研究不多，有研究对9个紫云英品种进行多态性分析，明确了适宜的取样量。
并且筛选到6对SSR引物扩增出条带稳定且明显的位点18个，将这9个紫云英品种区分为两个类群。
专家对紫云英的ISSR-PCR反应体系进行优化，从哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物中筛选出15对ISSR引物。
主要明确了最佳退火温度，并确定了适合紫云英ISSR分析的反应体系，分析了11个紫云英资源材料的遗传多样性。
台湾专家对紫云英以及台湾地区特有的A.nokoensis和A.nankotaizanensis进行遗传多样性分析，使用11对10-mer引物共扩增出131条RAPD条带，聚类结果清晰地划分为三类。
总的来说，目前尚未建立可靠的SSR技术可对紫云英种质资源的遗传多样性进行全面系统分析。
本研究利用高通量测序技术对紫云英基因组进行重测序，开发出具有多态性紫云英SSR分子标记，并对103份紫云英种质资源进行了分子水平上的遗传多样性分析，并构建了能够区分紫云英种质资源材料的分子指纹图谱。
本次可为紫云英种质资源的鉴定、利用以及后续的育种工作特别是杂交育种中亲本的选择提供依据。
紫云英SSR分子标记的开发
从紫云英地方品种“粤紫1号”、“宁波大桥”、“余江大叶”和国审品种“升钟”提取DNA，委托广州基迪奥生物科技有限公司进行Illumina10X高通量测序，得到原始重测序数据。
在原始测序数据中，共检测到6种碱基重复类型的36433个SSR标记，包含SSR标记的序列33975条，其中2249条序列包含2个及以上的SSR标记。
在SSR分子标记类型方面，以二碱基和三碱基两种重复类型居多，分别有15948个和13393个，各占总SSR标记数的43.8%和36.8%。
其中四碱基、五碱基、六碱基的SSR分子标记类型较少，分别有3868个、1333个和1177个，各占SSR标记总数的10.6%、3.7%和3.2%；以单碱基重复类型为最少数，仅有714个，占SSR标记总数的2.0%。
所有SSR分子标记中，二碱基重复基元AT/AT类型和三碱基重复基元AAG/CTT出现最多，SSR标记数为7040和7039个；二碱基重复基元AG/CT次之，SSR标记数为6698个。
此外，单碱基重复基元中出现较多的为A/T，SSR标记数为570个；二碱基重复基元中出现较多的还有AC/GT，SSR标记数为2170个。
三碱基重复基元中出现较多的还有AAT/ATT、ATC/ATG、AAC/GTT、ACC/GGT、AGG/CCT、ACT/AGT，分别有2138个、1309个、1228个、679个、413个和295个。
而四碱基重复基元中出现较多的类型是AAAT/ATTT、AAAG/CTTT、AACT/AGTT和AATT/AATT四种，SSR标记数为1442个、485个、358个和326个。
对重测序数据中缺失和插入位点进行分析，共获得可能存在的59个差异位点，获得引物117对。
对6份紫云英材料“吉田种”、“宁波大桥”、“湘紫1号”、“升钟”、“余江大叶”和“信紫1号”进行扩增，从117对引物中优选出15对能够稳定扩增条带清晰的多态性引物。
由上到下读取扩增条带的聚丙烯酰胺凝胶图，相同横向位置读取有条带的记为1，无条带或不易分辨的弱条带记为0，构建扩增产物的原始“0，1”矩阵。
利用15对SSR引物对103份材料的扩增结果共扩增出52个多态性位点，平均每个引物扩增出3.4个多态性位点。
其中13号引物扩增出6条多态性条带，为15对引物中最多；5、7、9和14号引物扩增出2条多态性条带，为15对引物中最少；其余引物扩增条带数居于3~5之间。
15对引物在103份紫云英种质资源材料中共扩增出等位基因55个，有效等位基因数在1.12~5.66间变化，均值为2.69，多样性指数在0.22~1.76间变化，均值为1.00。
多态性信息含量在0.799~0.101间变化，均值为0.504，多样性指数和多态性信息含量较高，表明引物扩增结果多态性较好。
此外，从结果可发现具有较多有效等位基因数的位点的平均期望杂合度、多样性指数和多态性信息含量也相对较高，四者具有相对一致的变化趋势，表明利用这15对引物可真实准确地反映出参试紫云英种质资源材料的遗传多样性。
紫云英种质资源聚类分析
接着采用类平均法，以遗传相似性系数为依据，对福建省农业科学院土壤肥料研究所提供的103份紫云英种质资源材料遗传多样性进行了分析，并绘制出亲缘关系树状图。
紫云英种质资源材料的遗传相似系数在0.753至1之间，均值为0.892，表明总体上各紫云英种质资源亲缘关系不远，遗传背景相对简单。
当遗传相似性系数为0.87时，可将紫云英种质资源材料分为3大类，A类包含80份材料、B类包含16份材料，C类包含7份材料，其拟合共相关系数r=0.641。
树状聚类图的A类中主要包括了产自安徽、湖北、江苏、广西、四川、陕西、河南的地方资源与育成品种，以及部分产自江西、浙江、湖南的地方资源与育成品种。
B类中主要包括41、42、44等10份产自浙江的地方资源和育成品种，以及2个产自湖南的育成品种。
C类中则包含3份江西地方资源、2份浙江地方资源、1份四川地方资源以及1份福建地方资源。
SSR分子标记是共显性标记，可信度高，多态性丰富，同时鉴定方法操作简便、成本低廉。近年来，SSR标记广泛应用于品种鉴定、遗传关系分析、DNA指纹图谱构建等研究中。
本研究中，以4个原产地间距离较远的紫云英地方品种的基因组重测序结果为基础，利用Prime3软件进行SSR分子标记位点识别。