文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
本次對4個品種的紫雲英開展了重測序，基于測序結果開發了15對多态性較好的SSR引物。
這15對SSR引物共擴增出等位基因52個，每對引物擴增出的平均有效等位基因數為2.69，平均多态性資訊含量為0.50。
利用這15對SSR引物對103份紫雲英種質資源的遺傳多樣性進行分析并繪制聚類圖。
在遺傳相似性系數為0.88時，可将所有的紫雲英種質資源分成3類，其拟合共相關系數為0.64，表明結果真實可靠。
紫雲英ISSR分析和分子标記技術
分子标記是植物遺傳多樣性研究的重要手段，較為常用的分子标記方法包括限制性擴增片段長度多态性、随機擴增多态性、擴增片段長度多态性、相關序列擴增多态性、簡單重複序列、單核苷酸多态性等。
簡單重複序列又可稱為SSR标記，已廣泛應用于各種農作物、園藝植物和草類植物的遺傳多樣性分析。
其原理是根據微衛星序列兩端保守性強的序列設計特異引物，通過PCR反應擴增微衛星片段。
由于核心序列串聯重複數目不同，因而PCR産物的長度也不同，每一擴增位點就代表這一位點的一對等位基因，由于SSR重複數目變化很大，可揭示多态性高。
以分子标記技術為基礎建立的指紋圖譜技術，具有鑒别速度快、結果可靠等特點，已廣泛應用于品種鑒定與親緣關系研究。
紫雲英是豆科黃芪屬越年生植物，作為中國南方水稻冬閑田最主要的綠肥作物，翻壓還田後大量莖葉和根茬腐解。
還可增加土壤腐殖質和全氮含量，活化和聚積礦質養分，發揮培肥改土的作用。此外，紫雲英具有觀賞、菜用等多種用途，是重要的蜜源和飼料作物。
中國是紫雲英的起源地，是世界上種植和利用紫雲英最早、栽培面積最大的國家。
新中國成立之前，紫雲英種植于長江中下遊地區及秦嶺-淮河一線，野生資源主要分布在北緯33度左右。
在新中國成立後，國家推廣綠肥種植，紫雲英種植面積大規模發展，向北延伸至河南南部、江蘇北部，向南延伸至兩廣地區，西至川渝地區，東至浙江、福建等東部沿海地區。
通過商業與文雲英從中國傳往東部鄰國南韓與日本，在20世紀40年代，日本北部地區廣泛種植紫雲英作綠肥作物，南部鄰國緬甸與越南也有紫雲英引種的曆史。
關于紫雲英種質資源遺傳多樣性的相關研究不多，有研究對9個紫雲英品種進行多态性分析，明确了适宜的取樣量。
并且篩選到6對SSR引物擴增出條帶穩定且明顯的位點18個，将這9個紫雲英品種區分為兩個類群。
專家對紫雲英的ISSR-PCR反應體系進行優化，從哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物中篩選出15對ISSR引物。
主要明确了最佳退火溫度，并确定了适合紫雲英ISSR分析的反應體系，分析了11個紫雲英資源材料的遺傳多樣性。
台灣專家對紫雲英以及台灣地區特有的A.nokoensis和A.nankotaizanensis進行遺傳多樣性分析，使用11對10-mer引物共擴增出131條RAPD條帶，聚類結果清晰地劃分為三類。
總的來說，目前尚未建立可靠的SSR技術可對紫雲英種質資源的遺傳多樣性進行全面系統分析。
本研究利用高通量測序技術對紫雲英基因組進行重測序，開發出具有多态性紫雲英SSR分子标記，并對103份紫雲英種質資源進行了分子水準上的遺傳多樣性分析，并建構了能夠區分紫雲英種質資源材料的分子指紋圖譜。
本次可為紫雲英種質資源的鑒定、利用以及後續的育種工作特别是雜交育種中親本的選擇提供依據。
紫雲英SSR分子标記的開發
從紫雲英地方品種“粵紫1号”、“甯波大橋”、“餘江大葉”和國審品種“升鐘”提取DNA，委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行Illumina10X高通量測序，得到原始重測序資料。
在原始測序資料中，共檢測到6種堿基重複類型的36433個SSR标記，包含SSR标記的序列33975條，其中2249條序列包含2個及以上的SSR标記。
在SSR分子标記類型方面，以二堿基和三堿基兩種重複類型居多，分别有15948個和13393個，各占總SSR标記數的43.8%和36.8%。
其中四堿基、五堿基、六堿基的SSR分子标記類型較少，分别有3868個、1333個和1177個，各占SSR标記總數的10.6%、3.7%和3.2%；以單堿基重複類型為最少數，僅有714個，占SSR标記總數的2.0%。
所有SSR分子标記中，二堿基重複基元AT/AT類型和三堿基重複基元AAG/CTT出現最多，SSR标記數為7040和7039個；二堿基重複基元AG/CT次之，SSR标記數為6698個。
此外，單堿基重複基元中出現較多的為A/T，SSR标記數為570個；二堿基重複基元中出現較多的還有AC/GT，SSR标記數為2170個。
三堿基重複基元中出現較多的還有AAT/ATT、ATC/ATG、AAC/GTT、ACC/GGT、AGG/CCT、ACT/AGT，分别有2138個、1309個、1228個、679個、413個和295個。
而四堿基重複基元中出現較多的類型是AAAT/ATTT、AAAG/CTTT、AACT/AGTT和AATT/AATT四種，SSR标記數為1442個、485個、358個和326個。
對重測序資料中缺失和插入位點進行分析，共獲得可能存在的59個差異位點，獲得引物117對。
對6份紫雲英材料“吉田種”、“甯波大橋”、“湘紫1号”、“升鐘”、“餘江大葉”和“信紫1号”進行擴增，從117對引物中優選出15對能夠穩定擴增條帶清晰的多态性引物。
由上到下讀取擴增條帶的聚丙烯酰胺凝膠圖，相同橫向位置讀取有條帶的記為1，無條帶或不易分辨的弱條帶記為0，建構擴增産物的原始“0，1”矩陣。
利用15對SSR引物對103份材料的擴增結果共擴增出52個多态性位點，平均每個引物擴增出3.4個多态性位點。
其中13号引物擴增出6條多态性條帶，為15對引物中最多；5、7、9和14号引物擴增出2條多态性條帶，為15對引物中最少；其餘引物擴增條帶數居于3~5之間。
15對引物在103份紫雲英種質資源材料中共擴增出等位基因55個，有效等位基因數在1.12~5.66間變化，均值為2.69，多樣性指數在0.22~1.76間變化，均值為1.00。
多态性資訊含量在0.799~0.101間變化，均值為0.504，多樣性指數和多态性資訊含量較高，表明引物擴增結果多态性較好。
此外，從結果可發現具有較多有效等位基因數的位點的平均期望雜合度、多樣性指數和多态性資訊含量也相對較高，四者具有相對一緻的變化趨勢，表明利用這15對引物可真實準确地反映出參試紫雲英種質資源材料的遺傳多樣性。
紫雲英種質資源聚類分析
接着采用類平均法，以遺傳相似性系數為依據，對福建省農業科學院土壤肥料研究所提供的103份紫雲英種質資源材料遺傳多樣性進行了分析，并繪制出親緣關系樹狀圖。
紫雲英種質資源材料的遺傳相似系數在0.753至1之間，均值為0.892，表明總體上各紫雲英種質資源親緣關系不遠，遺傳背景相對簡單。
當遺傳相似性系數為0.87時，可将紫雲英種質資源材料分為3大類，A類包含80份材料、B類包含16份材料，C類包含7份材料，其拟合共相關系數r=0.641。
樹狀聚類圖的A類中主要包括了産自安徽、湖北、江蘇、廣西、四川、陝西、河南的地方資源與育成品種，以及部分産自江西、浙江、湖南的地方資源與育成品種。
B類中主要包括41、42、44等10份産自浙江的地方資源和育成品種，以及2個産自湖南的育成品種。
C類中則包含3份江西地方資源、2份浙江地方資源、1份四川地方資源以及1份福建地方資源。
SSR分子标記是共顯性标記，可信度高，多态性豐富，同時鑒定方法操作簡便、成本低廉。近年來，SSR标記廣泛應用于品種鑒定、遺傳關系分析、DNA指紋圖譜建構等研究中。
本研究中，以4個原産地間距離較遠的紫雲英地方品種的基因組重測序結果為基礎，利用Prime3軟體進行SSR分子标記位點識别。