文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
BAG在真核生物中，是一种保守的辅助伴侣蛋白，是与B细胞淋巴瘤-2蛋白，相互作用的一种抗细胞凋亡蛋白。
最早发现的BAG1，可作为一种新型的抗细胞凋亡蛋白，参与细胞的程序性死亡，协同Bcl-2提高细胞存活。BAG的C末端保守的BAG结构域，可与分子伴侣70kDa热休克蛋白。
BAG家族在进化上保守，在动物、植物和酵母中都有发现。目前在拟南芥、水稻、玉米、番茄、香蕉、杨树和大豆等植物中的BAG蛋白均得到鉴定。
甘蔗是世界主要的糖料作物和生物燃料。目前认为现代甘蔗栽培品种，是由热带种和割手密的种间杂交，然后和热带种回交而来。
长期以来，甘蔗基因组的复杂性，阻碍了甘蔗分子生物学的研究。直到如今，单倍体甘蔗割手密AP85-441基因组序列组装完成，为甘蔗遗传研究和分子育种提供了便利。
实验的材料与方法
为了鉴定甘蔗割手密种BAG基因家族成员，从PFAM数据库下载BAG保守结构域的隐马可夫模型文件，同时用拟南芥、水稻和玉米BAG蛋白为参考序列。
使用HMMER3.1程序和BLASTP相结合的方法，对甘蔗割手密种蛋白数据库进行检索，HMMER和BLAST的E值分别设置为1e-10和1e-5。
为研究甘蔗BAG蛋白在植物中的进化关系，使用MEGA-X软件的ClustaW算法对甘蔗割手密、拟南芥、水稻、玉米、番茄、香蕉和杨树的BAG蛋白序列进行多序列比对。
用邻接法构建系统进化树，设置1000次Bootstrap重复检验，然后利用Evolvie在线网站对系统进化树进行美化。
通过MEME在线网站设置，查找1~10个宽度为6~50个氨基酸的基序，以进行甘蔗割手密种BAG蛋白保守基序的分析。
并根据基因组注释文件，使用TBtools中的GeneStructureView工具对保守基序、保守结构域和基因结构进行可视化。
实验结果分析
在甘蔗割手密种AP85-441基因组中，共鉴定到24个BAG基因家族成员。根据甘蔗割手密与水稻的同源基因比对和聚类结果，参考水稻中同源基因的名称命名甘蔗BAG基因。
在此基础上，将属于割手密中相应同源染色体A、B、C和D的等位基因，用相应的字母“a”、“b”、“c”和“d”进行区分。
而在水稻中没有同源基因的SsBAGs，则按其蛋白序列的相似性分别命名为SsBAG7和SsBAG8，在该情况下虽然有聚在同一分支的成员，但因为它们并不都是同源染色体组上的等位基因，因此改用数字1、2、3和4表示。
因此，SsBAGs的名称中包含了水稻中直系同源基因，以及割手密自身基因组内同源染色体的信息。
理化性质分析结果显示，甘蔗BAG基因的编码氨基酸序列长度在140~1318理论等电点在4.70~10.19，包括9个酸性蛋白和15个碱性蛋白。
分子量在15.45~145.38kDa，蛋白质不稳定系数在37.03~71.96，除SsBAG4a/b/c/d是稳定蛋白外，其余均为不稳定蛋白。
共有15个SsBAGs具有细胞质和细胞核定位信号，6个SsBAGs只具有细胞核定位信号，SsBAG5b、SsBAG5c和SsBAG8.4则预测定位在叶绿体中。
为了阐明甘蔗割手密BAG基因家族的进化关系，使用甘蔗割手密、拟南芥、水稻、玉米、番茄、香蕉和杨树的总共87个BAG蛋白，采用邻接法构建系统进化树。
根据系统发育关系，将甘蔗割手密BAG基因家族成员，划分为GroupⅠ、GroupⅡ-1和GroupⅡ-2共3个组。SsBAGs在GroupⅠ中数量最多，有18个GroupⅡ-1有4个，GroupⅡ-2有2个。
除SsBAG8.1~8.4与杨树PtrBAG3相似性较高外，甘蔗SsBAGs与单子叶玉米ZmBAGs和水稻OsBAGs的进化距离，相较于双子叶植物拟南芥AtBAGs更近。
在植物中，BAG蛋白中的BAG结构域可以与Hsp70蛋白的ATPase结构域相互作用并调节其活性。UBQ作为类泛素结构域，在细胞凋亡和蛋白质折叠等途径中发挥重要作用。
IQ结构域则可以通过感知钙水平的变化，来调节结合蛋白的活性，使得BAG可以充当连接钙信号传导和伴侣蛋白的枢纽。
在研究中，24个甘蔗割手密BAG蛋白均含有一个保守的BAG结构域。GroupⅠ的15个成员中，大部分成员都含有UBQ和BD两个结构域，而GroupⅡ成员都含有BD和IQ结构域。
虽然SsBAG8.1、SsBAG8.2和SsBAG8.3属于GroupI成员，但它们本应为UBQ编码区的序列，发生了突变致使UBQ结构域缺失。
因此这三个蛋白只预测到BAG结构域，这在拟南芥和水稻中从未有报道，表明甘蔗多倍化可能导致了BAG蛋白在一定程度上的功能分化。
通过对保守基序组成的分析，可进一步说明甘蔗BAG蛋白间的微妙差异。
结果表明，所有SsBAGs均含有motif3，且在系统发育树中，处于同一聚类分支BAG蛋白的基序的分布顺序和数量相似，说明甘蔗BAG蛋白的基序具有一定程度的保守性。
GroupⅠ共有8个保守基序，而编码完整BD并具有UBQ的成员均含有5个共同的motifs，表明这些motifs对维持正常蛋白结构功能的重要性。
GroupⅡ-1和GroupⅡ-2有共同的motif3和motif9，而motif7也出现在这两个组的一些成员中。
GroupⅠ与GroupⅡ-1的motif分布顺序和数量差异很大，而GroupⅡ-2与GroupⅡ-1拥有相同的motif9，以及与GroupⅠ拥有相同的motif2，这表明GroupⅡ-2为中间类型。
基因结构分析结果表明，SsBAGs含有1~8个外显子。除SsBAG6b和SsBAG6c仅有1个外显子没有内含子之外，其余的家族成员至少有1个内含子。
其中13个SsBAGs含有4个外显子，6个SsBAGs包含3个外显子。GroupⅡ中的成员没有UTR，而GroupⅠ中7个成员的5’和3’两端均有UTRs。
SsBAG8.2和SsBAG8.3的基因序列比其他BAG基因更长，但这些序列主要是内含子，所以最终编码的蛋白质大小正常，无额外的结构域。
SsBAG7.1和SsBAG7.2具有最多的外显子和最长的蛋白质序列，但在这些蛋白质没有预测到额外结构域。
24个甘蔗割手密BAG基因分布在的19条染色体上，在Chr3A，Chr4B，Chr5B，Chr6B和Chr6C这5条染色体上，分别有2个BAG基因，其余14条染色体上均只有1个BAG基因。
而在Chr1和Chr7这两个同源染色体组上不包含BAG基因，以及在Chr5B上检测到一个可能的串联重复基因对。
在甘蔗割手密BAG成员中，只有2个BAG成员的复制类型为分散复制，其余22个均为全基因组复制或片段复制。
可见，全基因组复制或片段复制，是甘蔗割手密BAG家族扩张的主要方式，符合多倍体植物物种基因家族扩增的特点。
实验结果讨论
BAG蛋白是一类多功能的伴侣调节蛋白，和植物生长发育调控有关，也在植物响应干旱、盐碱、高温和低温等逆境胁迫中发挥作用。
与动物相比，对植物BAG蛋白的功能研究还不够深入。BAG蛋白在甘蔗中的鉴定和表达模式分析，尚未见报道。
本研究对甘蔗BAG基因的系统发育，和转录图谱开展了全面分析，为揭示BAG的生物学功能提供了有用的线索。
需要说明的是，和基于染色体位置的命名方式有所不同，本实验中SsBAGs的命名，是基于其在水稻中的同源成员的序列相似性，参考水稻中已有的BAG命名。
因此，甘蔗BAG蛋白与它们在水稻中对应名称的BAG成员具有相似的序列和保守结构域。比如，SsBAG1/2/3/4与他们水稻中的同源蛋白含有BD和UBQ，而SsBAG5和SsBAG6也如预期的那样具有BD和IQ两个结构域。
而且BAG家族中同一组成员具有相似的基序组成、基因结构、cDNA长度和蛋白质等电点。研究发现SsBAGs在甘蔗中的表达模式，与其在水稻中的同源基因的表达模式非常相似。
与它们在水稻中的同源基因一样，甘蔗中的SsBAG1/2/3/4，在不同发育阶段的许多组织中，都表现出高水平的表达，而其他基因则在特定的区域或阶段表现出低或中等的表达。
结果表明，SsBAG1/2及其水稻中的同源基因在成熟期茎中的转录水平较高，而SsBAG3/4及其水稻中的同源基因在幼嫩的茎中的转录水平较高。
此外，甘蔗BAG基因在干旱处理下的表达变化，与其在水稻中的同源基因之间也相似。干旱处理后，在水稻和甘蔗的BAG1/3基因在耐受品种中表达显著下调，而BAG4/6基因的表达则都无显著变化。
因此，可以推测甘蔗SsBAG基因，和对应的水稻OsBAG基因的信息可相互参考。
比如，水稻中OsBAG5/6在生殖生长期的组织器官中有明显的表达，可以预期甘蔗SsBAG5/6在生殖生长期有表达。
反过来，甘蔗SsBAG2/5在干旱胁迫下的表达模式，可以为水稻中OsBAG2/5在干旱胁迫下的表达提供信息。
本研究中的甘蔗BAG家族，和前人报道过的甘蔗AP2/ERF等家族在基因复制和扩增后，其表达均被基本保留而得到倍增，推测在甘蔗多倍化后相关基因的功能得到增强。
这种特征，可能与甘蔗作为多年生作物的抗逆性、抗病性和再生性相关，具有进化上的有积极的意义。
研究基于甘蔗割手密AP85-441高质量基因组，利用生物信息学方法，在全基因组水平鉴定了，包含等位基因在内的24个甘蔗割手密BAG基因家族成员，并对其进化关系、序列特征和表达模式进行了系统分析。
同时，RT-qPCR实验表明ScBAG1a、ScBAG3a和ScBAG4a的表达量，均在干旱处理后显著下调，暗示其可能在甘蔗响应干旱胁迫的过程中发挥作用。
亚细胞定位实验表明，ScBAG1a和ScBAG2a均定位于细胞质和细胞核。该研究结果为进一步研究甘蔗BAG基因家族的功能奠定基础，同时为甘蔗抗性育种提供候选靶基因和新思路。