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Malectin是一种新发现的Ⅰ型膜锚定凝集素。
该蛋白质首次被发现存在于非洲爪蟾中，与该蛋白质结合的第一类糖是麦芽糖。
脊椎动物中的Malectin主要参与内质网糖蛋白的质量控制，识别错误折叠的糖蛋白。
有研究表明，扇贝中Malectin参与先天免疫，植物细胞壁中含有Malectin结构域的蛋白质参与调节不同的免疫应激反应，细菌中含有类似Malectin结构域的蛋白质可以作为细胞壁水解酶的CBM发挥作用。
这些结果表明，动物、植物和微生物中均含有Malectin同源序列，但发挥不同的功能。
柞蚕是中国特有的一种经济昆虫，其免疫系统薄弱，极其容易受到危害。
因此，对柞蚕免疫系统进行研究至关重要。
本研究克隆柞蚕Malectin基因，并连接到原核表达载体进行表达，获得重组蛋白，研究其结合和抑制细菌的作用。
同时，将基因插入柞蚕核型多角体病毒表达载体，通过体外转染昆虫细胞和体内转染柞蚕蛹，探究其对ApNPV病毒的抑制功能，为今后开展柞蚕免疫系统的研究奠定基础。
Escherichia coli(E.coli)DH5α、E. coli BL21(DE3)菌株购自全式金公司；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)均由大连理工大学包永明教授赠送；昆虫细胞Tn-High Five和柞蚕蛹青6号由实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ均购自TaKaRa公司；His-tag鼠多抗购自康为世纪；ELISA显色试剂盒购自碧云天；HisTrapFF(1 mL)购自GE公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
根据柞蚕cDNA数据库，用Snap Gene设计如下特异性引物，ApMLEC-F1:5′-GGATCCATGGTGTATCAG-ATATTTACCACAT-3′，ApMLEC-R1;5′-CTCGAGAAGT-TTGCAGAGGCAGAATAAT-3′(下划线为Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点);ApMLEC-F2:5′-CCGCCATAGCACTGATGATGAGCCGACAATT-3′，ApMLEC-R2:5′-AGGTT-TTCCTCGAGAATACGTAAGTTGGGAT-3′;ApMLEC-F3:5′-CAGCGAACAAGGATGGTGATAATGCTCCCAACATG-AAA-3′，ApMLEC-R3:5′-TTTCATGTTGGGAGCATTATC-ACCATCCTTGTTCGCTG-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。
取柞蚕脂肪体，液氮研磨，提取RNA，反转录为cDNA。
以cDNA为模板，用ApMLEC-F1/ApMLEC-R1进行PCR扩增。
反应条件：94 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 35个循环；72 ℃再延伸10 min。
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收产物并连接至pMD19-T载体进行测序分析。
将测序正确的ApMLEC基因对应的氨基酸序列输入ExPASyProtParam[10](https: //web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质理化性质。
使用SMART(http: //smart.embl.de/)进行蛋白质结构域分析。
使用SignalP-5.0(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白质信号肽。
对重组质粒和表达载体用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收酶切产物。
目的基因和表达载体在T4 DNA连接酶作用下4 ℃连接过夜，连接产物转化至E.coli DH5α，提取质粒进行酶切鉴定，正确的重组载体命名为pET/ApMLEC，并转化E. coli BL21(DE3)菌株中，在37 ℃，1.0 mmol/L IPTG条件下培养30 h。
离心收集菌体，超声破碎，4 ℃、12 000 r/min离心10 min， 去掉上清液，参照文献方法处理沉淀，获得含有目的蛋白的液体。
纯化原液流经HisTrapFF层析柱后用含有500 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白。
纯化后的ApMLEC重组蛋白经SDS-PAGE和Western Blot检测分析后，运用Bradford法测定质量浓度。
取麦芽糖、异麦芽糖、脂多糖、肽聚糖各4 μg， 参照文献包被96孔酶联板，1 mg/mL BSA封闭2 h后，加入初始质量浓度1 mg/mL、经2n梯度稀释的ApMLEC蛋白液100 μL/孔，37 ℃反应1 h， 再加入His单克隆抗体，37 ℃反应1 h， 加入HRP-羊抗小鼠抗体，37 ℃反应1 h， MBP底物液显色30 min， 加入终止液，测OD450值。
以BSA蛋白为对照，每组实验重复3次。
选取3株革兰氏阴性菌(大肠杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、铜绿假单胞菌)和2株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、植物乳杆菌)，将菌株培养至对数期，离心后用PBS清洗2次。
在96孔板中，25 μL菌悬液(1×106 CFU/mL)与25 μL ApMLEC蛋白(200 μg/mL)室温孵育1 h， 每组实验重复3次，用光学显微镜观察细菌凝集。
以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抑菌对象，Kana为阳性对照，PBS为阴性对照，采用杯碟法测定1 000、500、250和125 μg/mL等4种质量浓度下ApMLEC的抑菌作用，每组实验重复3次，取3次测量平均值计算抑菌活性。
收集感染ApNPV/egfp重组病毒的柞蚕血淋巴为病毒液母液，用无血清细胞培养基按1∶10(体积分数)的比例稀释，经0.22 μm滤器过滤除菌。
将大肠杆菌表达的ApMLEC蛋白与稀释10-4倍ApNPV/egfp重组病毒等体积添加至已接种Tn-High Five细胞的24孔细胞培养板，对照组添加等体积病毒和BSA，置于27 ℃培养箱培养3 d， 观察细胞产生荧光情况，每组实验重复3次。
以ApMLEC为模板，分别用ApMLEC-F2/ApMLEC-R3与ApMLEC-F3/ApMLEC-R2为引物进行PCR扩增，再以回收的两种扩增产物混合物为模板，ApMLEC-F2/ApMLEC-R2为引物进行扩增，制备碳水化合物结合区域删除的ApMLEC缺陷基因(eApMLEC-)，用ApMLEC-F2/ApMLEC-R2克隆完整基因(eApMLEC)。
将eApMLEC、eApMLEC-利用无缝克隆的方式连接至pApBacDual-egfp，构建真核表达转移载体pApBacDual-egfp/eApMLEC和pApBacDual-egfp/eApMLEC-。
两种载体分别转化至DH10Bac宿主菌中，通过蓝白斑筛选，获得含有目的基因和荧光基因的重组病毒杆粒ApNPV/egfp/eApMLEC和ApNPV/egfp/eApMLEC-。
将两种杆粒均分别转染至昆虫Tn-High Five细胞和柞蚕蛹。
细胞培养48 h， 柞蚕蛹培养14～16 d后，通过倒置显微镜观察绿色荧光的产生情况，每组实验重复3次。
以合成的cDNA为模板，对ApMLEC进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳获得约800 bp的DNA片段。
测序和生物信息学分析显示该基因包含798 bp的ORF，编码266个氨基酸。
全长ApMLEC蛋白的预测分子质量为29.9 ku， 等电点为5.12，1～21位氨基酸为信号肽，介导碳水化合物相互作用的4个芳香残基是Y77、Y99、Y109和F110，244～263位氨基酸为跨膜结构域，26～188位氨基酸为Malectin-domain结构域。
将ApMLEC序列信息提交至NCBI-GenBank数据库，登录号为OL519584。
将pET/ApMLEC转化到E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后用HisTrapFF层析柱纯化获得重组蛋白。
经鉴定，条带无其他杂带。
应用Bradford法测定蛋白质量浓度为0.85～1.18 mg/mL。
为探究ApMLEC结合多糖活性，利用ELISA法测定。
结果显示，随着重组融合蛋白质量浓度的升高，分别拟合4种糖所得的OD450值均呈现上升趋势，表明ApMLEC可以与麦芽糖、异麦芽糖、脂多糖和肽聚糖发生结合。
柞蚕ApMLEC可以使多种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、甲基营养型芽孢杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、植物乳杆菌)形成聚集体，空白对照组和BSA组未观察到该现象，表明ApMLEC促进细菌凝集。
为探究ApMLEC抑菌活性，采用杯蝶法测定。
结果所示，质量浓度为1 mg/mL的ApMLEC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有一定抑制作用。
且如所示，抑菌圈直径随着ApMLEC质量浓度的减少而减小。
当ApMLEC的质量浓度小于250 μg/mL时没有抑菌效果，表明250 μg/mL为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度，最小抑菌直径分别为14.23 mm和18.10 mm。
为检测外源性ApMLEC对ApNPV/egfp重组病毒的影响，利用体外添加ApMLEC蛋白探究抑制病毒效果，荧光观察结果显示，实验组与对照组无明显变化，即外源性ApMLEC对ApNPV/egfp重组病毒的复制和表达影响较小或者无影响。
为检测内源性ApMLEC对ApNPV病毒的影响，通过转染重组病毒杆粒ApNPV/egfp/eApMLEC至细胞和柞蚕蛹，结果均显示无法产生荧光，即重组病毒复制表达受到抑制;转染ApNPV/egfp/eApMLEC-杆粒至细胞和柞蚕蛹的实验结果均显示有荧光出现，即重组病毒正常表达。
综上所述，内源性ApMLEC具有抑制ApNPV病毒复制表达的作用。
在已知的柞蚕cDNA数据库中挖掘得到一条新的凝集素基因。
对ApMLEC序列进行生物信息学分析，结果显示，在26～188位氨基酸存在Malectin-domain结构域。
Malectin是一种新发现的凝集素，定位于ER，结合内质网聚糖中间体G2M9，在糖蛋白质量控制中发挥作用。
不同生物体内Malectin或者包含类Malectin结构域的蛋白所发挥的作用存在差异。
Yang等研究发现，植物免疫系统中含有类似Malectin结构域的模式识别受体在应激反应方面发挥一定作用；Sellaththurai等研究表明，大腹海马的Malectin存在免疫潜能。
然而对柞蚕ApMLEC发挥作用的报道信息是有限的。
大肠杆菌表达系统是目前最常用的研究外源蛋白表达系统，通过该系统获得ApMLEC，初步探究其生物学功能。
Schallus等研究表明，在体外Malectin结合葡二糖，例如麦芽糖和黑曲霉糖，后者是ER中潜在的天然配体。
为探究ApMLEC结合多糖能力，通过ELISA测定，结果发现其可以与麦芽糖、脂多糖和肽聚糖发生结合。
有研究表明，微生物表面存在的脂多糖或者肽聚糖等病原模式相关分子是昆虫凝集素识别的重要靶标，它们之间的相互作用可以启动宿主防御机制，因此ApMLEC结合多糖结果暗示其可能存在免疫潜能。
以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抑菌对象，探究1 000、500、250和125 μg/mL等4种质量浓度下ApMLEC的抑菌作用。
结果显示，纯化所得的外源性ApMLEC能够凝集和抑制部分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，最小抑菌质量浓度均为250 μg/mL，但对ApNPV/egfp重组病毒无抑制作用或者抑制作用较小。
出现这种现象的原因可能是柞蚕凝集素ApMLEC是一种内源性表达的蛋白质，与人源Malectin是一种内质网驻留凝集素性质相似，但具体表达位置还有待经过细胞定位进一步确定。
为检测内源性ApMLEC是否存在抑制病毒复制表达的作用，构建该基因真核表达载体ApNPV/egfp/eApMLEC，同时通过基因搭桥的方式，获得ApMLEC功能区被删除的缺陷基因eApMLEC-，并构建表达载体ApNPV/egfp/eApMLEC-作为对照。
两种载体均分别转染昆虫细胞和柞蚕蛹，结果显示，内源性表达的ApMLEC能够抑制ApNPV病毒的复制表达。
先前的研究表明，在内质网应激条件下，折叠异常蛋白的积累诱导Malectin高表达，Malectin和ribophorin I形成复杂的结构，并选择性将它们转运到细胞质以进行ER相关降解(ERAD)，有研究也印证了Malectin与折叠异常的HA病毒相关。
聚糖是许多病毒表面的重要组成部分，而病毒依赖宿主细胞机制来合成糖蛋白。
因此，抗病毒实验结果暗示，柞蚕ApMLEC可能同样参与内质网糖蛋白的质量控制，干扰内质网出现的正在发生糖基化修饰的病毒糖蛋白，抑制病毒的复制表达。
目前，抑制ER病毒糖蛋白折叠机制是开发部分抗病毒药物的策略之一，已有通过亚氨基糖竞争性抑制葡萄糖苷酶I和II，从而抑制新生糖蛋白，进而阻断丝状病毒糖蛋白折叠的研究。
因此，以上实验结果说明对ApMLEC免疫潜能的进一步探索有利于更好地认识柞蚕免疫。
| ApMLEC质量浓度 Mass concentration of ApMLEC/(μg/mL) | 抑制区直径 Diameter of suppression zone/mm | |
| E.coli | S.aureus | |
| 250 | 14.23±0.21** | 18.10±0.10** |
| 500 | 17.53±0.32** | 21.20±0.26** |
| 1 000 | 20.53±0.15** | 26.40±0.10** |
| Kana(10 mg/mL) | 26.47±0.45 | 30.27±0.25 |
| PBS | — | — |
ApMLEC对细菌的抑制
| 细菌 Bacteria | ApMLEC质量浓度Mass concentration of ApMLEC/(μg/mL) | |||||
| 125 | 250 | 500 | 1 000 | Kana | PBS | |
| E.coli | - | + | + | + | + | - |
| S.aureus | - | + | + | + | + | - |
注：“-”表示对细菌无抑制作用；“+”表示对细菌有抑制作用。
本研究通过大肠杆菌表达系统成功纯化ApMLEC，初步探究其结合麦芽糖配体的生物学活性，以及结合和抑制多种细菌的能力，也进一步验证了内源性ApMLEC对ApNPV病毒的抑制作用。
综上所述，ApMLEC可能在柞蚕先天免疫中发挥重要作用，研究结果为预防柞蚕感病提供新的思路和方法。