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Malectin是一種新發現的Ⅰ型膜錨定凝集素。
該蛋白質首次被發現存在于非洲爪蟾中，與該蛋白質結合的第一類糖是麥芽糖。
脊椎動物中的Malectin主要參與内質網糖蛋白的品質控制，識别錯誤折疊的糖蛋白。
有研究表明，扇貝中Malectin參與先天免疫，植物細胞壁中含有Malectin結構域的蛋白質參與調節不同的免疫應激反應，細菌中含有類似Malectin結構域的蛋白質可以作為細胞壁水解酶的CBM發揮作用。
這些結果表明，動物、植物和微生物中均含有Malectin同源序列，但發揮不同的功能。
柞蠶是中國特有的一種經濟昆蟲，其免疫系統薄弱，極其容易受到危害。
是以，對柞蠶免疫系統進行研究至關重要。
本研究克隆柞蠶Malectin基因，并連接配接到原核表達載體進行表達，獲得重組蛋白，研究其結合和抑制細菌的作用。
同時，将基因插入柞蠶核型多角體病毒表達載體，通過體外轉染昆蟲細胞和體内轉染柞蠶蛹，探究其對ApNPV病毒的抑制功能，為今後開展柞蠶免疫系統的研究奠定基礎。
Escherichia coli(E.coli)DH5α、E. coli BL21(DE3)菌株購自全式金公司；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、甲基營養型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)均由大連理工大學包永明教授贈送；昆蟲細胞Tn-High Five和柞蠶蛹青6号由實驗室儲存；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ均購自TaKaRa公司；His-tag鼠多抗購自康為世紀；ELISA顯色試劑盒購自碧雲天；HisTrapFF(1 mL)購自GE公司；其他試劑均為國産分析純試劑。
根據柞蠶cDNA資料庫，用Snap Gene設計如下特異性引物，ApMLEC-F1:5′-GGATCCATGGTGTATCAG-ATATTTACCACAT-3′，ApMLEC-R1;5′-CTCGAGAAGT-TTGCAGAGGCAGAATAAT-3′(下劃線為Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點);ApMLEC-F2:5′-CCGCCATAGCACTGATGATGAGCCGACAATT-3′，ApMLEC-R2:5′-AGGTT-TTCCTCGAGAATACGTAAGTTGGGAT-3′;ApMLEC-F3:5′-CAGCGAACAAGGATGGTGATAATGCTCCCAACATG-AAA-3′，ApMLEC-R3:5′-TTTCATGTTGGGAGCATTATC-ACCATCCTTGTTCGCTG-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。
取柞蠶脂肪體，液氮研磨，提取RNA，反轉錄為cDNA。
以cDNA為模闆，用ApMLEC-F1/ApMLEC-R1進行PCR擴增。
反應條件：94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 35個循環；72 ℃再延伸10 min。
PCR擴增産物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收産物并連接配接至pMD19-T載體進行測序分析。
将測序正确的ApMLEC基因對應的氨基酸序列輸入ExPASyProtParam[10](https: //web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質理化性質。
使用SMART(http: //smart.embl.de/)進行蛋白質結構域分析。
使用SignalP-5.0(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白質信号肽。
對重組質粒和表達載體用Bam HⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收酶切産物。
目的基因和表達載體在T4 DNA連接配接酶作用下4 ℃連接配接過夜，連接配接産物轉化至E.coli DH5α，提取質粒進行酶切鑒定，正确的重組載體命名為pET/ApMLEC，并轉化E. coli BL21(DE3)菌株中，在37 ℃，1.0 mmol/L IPTG條件下培養30 h。
離心收集菌體，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min， 去掉上清液，參照文獻方法處理沉澱，獲得含有目的蛋白的液體。
純化原液流經HisTrapFF層析柱後用含有500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白。
純化後的ApMLEC重組蛋白經SDS-PAGE和Western Blot檢測分析後，運用Bradford法測定品質濃度。
取麥芽糖、異麥芽糖、脂多糖、肽聚糖各4 μg， 參照文獻包被96孔酶聯闆，1 mg/mL BSA封閉2 h後，加入初始品質濃度1 mg/mL、經2n梯度稀釋的ApMLEC蛋白液100 μL/孔，37 ℃反應1 h， 再加入His單克隆抗體，37 ℃反應1 h， 加入HRP-羊抗小鼠抗體，37 ℃反應1 h， MBP底物液顯色30 min， 加入終止液，測OD450值。
以BSA蛋白為對照，每組實驗重複3次。
選取3株革蘭氏陰性菌(大腸杆菌、甲基營養型芽孢杆菌、銅綠假單胞菌)和2株革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、植物乳杆菌)，将菌株培養至對數期，離心後用PBS清洗2次。
在96孔闆中，25 μL菌懸液(1×106 CFU/mL)與25 μL ApMLEC蛋白(200 μg/mL)室溫孵育1 h， 每組實驗重複3次，用光學顯微鏡觀察細菌凝集。
以大腸杆菌和金黃色葡萄球菌為抑菌對象，Kana為陽性對照，PBS為陰性對照，采用杯碟法測定1 000、500、250和125 μg/mL等4種品質濃度下ApMLEC的抑菌作用，每組實驗重複3次，取3次測量平均值計算抑菌活性。
收集感染ApNPV/egfp重組病毒的柞蠶血淋巴為病毒液母液，用無血清細胞培養基按1∶10(體積分數)的比例稀釋，經0.22 μm濾器過濾除菌。
将大腸杆菌表達的ApMLEC蛋白與稀釋10-4倍ApNPV/egfp重組病毒等體積添加至已接種Tn-High Five細胞的24孔細胞培養闆，對照組添加等體積病毒和BSA，置于27 ℃培養箱培養3 d， 觀察細胞産生熒光情況，每組實驗重複3次。
以ApMLEC為模闆，分别用ApMLEC-F2/ApMLEC-R3與ApMLEC-F3/ApMLEC-R2為引物進行PCR擴增，再以回收的兩種擴增産物混合物為模闆，ApMLEC-F2/ApMLEC-R2為引物進行擴增，制備碳水化合物結合區域删除的ApMLEC缺陷基因(eApMLEC-)，用ApMLEC-F2/ApMLEC-R2克隆完整基因(eApMLEC)。
将eApMLEC、eApMLEC-利用無縫克隆的方式連接配接至pApBacDual-egfp，建構真核表達轉移載體pApBacDual-egfp/eApMLEC和pApBacDual-egfp/eApMLEC-。
兩種載體分别轉化至DH10Bac宿主菌中，通過藍白斑篩選，獲得含有目的基因和熒光基因的重組病毒杆粒ApNPV/egfp/eApMLEC和ApNPV/egfp/eApMLEC-。
将兩種杆粒均分别轉染至昆蟲Tn-High Five細胞和柞蠶蛹。
細胞培養48 h， 柞蠶蛹培養14～16 d後，通過倒置顯微鏡觀察綠色熒光的産生情況，每組實驗重複3次。
以合成的cDNA為模闆，對ApMLEC進行PCR擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳獲得約800 bp的DNA片段。
測序和生物資訊學分析顯示該基因包含798 bp的ORF，編碼266個氨基酸。
全長ApMLEC蛋白的預測分子品質為29.9 ku， 等電點為5.12，1～21位氨基酸為信号肽，介導碳水化合物互相作用的4個芳香殘基是Y77、Y99、Y109和F110，244～263位氨基酸為跨膜結構域，26～188位氨基酸為Malectin-domain結構域。
将ApMLEC序列資訊送出至NCBI-GenBank資料庫，登入号為OL519584。
将pET/ApMLEC轉化到E.coli BL21(DE3)，經IPTG誘導後用HisTrapFF層析柱純化獲得重組蛋白。
經鑒定，條帶無其他雜帶。
應用Bradford法測定蛋白品質濃度為0.85～1.18 mg/mL。
為探究ApMLEC結合多糖活性，利用ELISA法測定。
結果顯示，随着重組融合蛋白品質濃度的升高，分别拟合4種糖所得的OD450值均呈現上升趨勢，表明ApMLEC可以與麥芽糖、異麥芽糖、脂多糖和肽聚糖發生結合。
柞蠶ApMLEC可以使多種革蘭氏陰性細菌(大腸杆菌、銅綠假單胞菌、甲基營養型芽孢杆菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、植物乳杆菌)形成聚集體，空白對照組和BSA組未觀察到該現象，表明ApMLEC促進細菌凝集。
為探究ApMLEC抑菌活性，采用杯蝶法測定。
結果所示，品質濃度為1 mg/mL的ApMLEC對大腸杆菌和金黃色葡萄球菌的生長具有一定抑制作用。
且如所示，抑菌圈直徑随着ApMLEC品質濃度的減少而減小。
當ApMLEC的品質濃度小于250 μg/mL時沒有抑菌效果，表明250 μg/mL為大腸杆菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌品質濃度，最小抑菌直徑分别為14.23 mm和18.10 mm。
為檢測外源性ApMLEC對ApNPV/egfp重組病毒的影響，利用體外添加ApMLEC蛋白探究抑制病毒效果，熒光觀察結果顯示，實驗組與對照組無明顯變化，即外源性ApMLEC對ApNPV/egfp重組病毒的複制和表達影響較小或者無影響。
為檢測内源性ApMLEC對ApNPV病毒的影響，通過轉染重組病毒杆粒ApNPV/egfp/eApMLEC至細胞和柞蠶蛹，結果均顯示無法産生熒光，即重組病毒複制表達受到抑制;轉染ApNPV/egfp/eApMLEC-杆粒至細胞和柞蠶蛹的實驗結果均顯示有熒光出現，即重組病毒正常表達。
綜上所述，内源性ApMLEC具有抑制ApNPV病毒複制表達的作用。
在已知的柞蠶cDNA資料庫中挖掘得到一條新的凝集素基因。
對ApMLEC序列進行生物資訊學分析，結果顯示，在26～188位氨基酸存在Malectin-domain結構域。
Malectin是一種新發現的凝集素，定位于ER，結合内質網聚糖中間體G2M9，在糖蛋白品質控制中發揮作用。
不同生物體内Malectin或者包含類Malectin結構域的蛋白所發揮的作用存在差異。
Yang等研究發現，植物免疫系統中含有類似Malectin結構域的模式識别受體在應激反應方面發揮一定作用；Sellaththurai等研究表明，大腹海馬的Malectin存在免疫潛能。
然而對柞蠶ApMLEC發揮作用的報道資訊是有限的。
大腸杆菌表達系統是目前最常用的研究外源蛋白表達系統，通過該系統獲得ApMLEC，初步探究其生物學功能。
Schallus等研究表明，在體外Malectin結合葡二糖，例如麥芽糖和黑曲黴糖，後者是ER中潛在的天然配體。
為探究ApMLEC結合多糖能力，通過ELISA測定，結果發現其可以與麥芽糖、脂多糖和肽聚糖發生結合。
有研究表明，微生物表面存在的脂多糖或者肽聚糖等病原模式相關分子是昆蟲凝集素識别的重要靶标，它們之間的互相作用可以啟動宿主防禦機制，是以ApMLEC結合多糖結果暗示其可能存在免疫潛能。
以大腸杆菌和金黃色葡萄球菌為抑菌對象，探究1 000、500、250和125 μg/mL等4種品質濃度下ApMLEC的抑菌作用。
結果顯示，純化所得的外源性ApMLEC能夠凝集和抑制部分革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，最小抑菌品質濃度均為250 μg/mL，但對ApNPV/egfp重組病毒無抑制作用或者抑制作用較小。
出現這種現象的原因可能是柞蠶凝集素ApMLEC是一種内源性表達的蛋白質，與人源Malectin是一種内質網駐留凝集素性質相似，但具體表達位置還有待經過細胞定位進一步确定。
為檢測内源性ApMLEC是否存在抑制病毒複制表達的作用，建構該基因真核表達載體ApNPV/egfp/eApMLEC，同時通過基因搭橋的方式，獲得ApMLEC功能區被删除的缺陷基因eApMLEC-，并建構表達載體ApNPV/egfp/eApMLEC-作為對照。
兩種載體均分别轉染昆蟲細胞和柞蠶蛹，結果顯示，内源性表達的ApMLEC能夠抑制ApNPV病毒的複制表達。
先前的研究表明，在内質網應激條件下，折疊異常蛋白的積累誘導Malectin高表達，Malectin和ribophorin I形成複雜的結構，并選擇性将它們轉運到細胞質以進行ER相關降解(ERAD)，有研究也印證了Malectin與折疊異常的HA病毒相關。
聚糖是許多病毒表面的重要組成部分，而病毒依賴宿主細胞機制來合成糖蛋白。
是以，抗病毒實驗結果暗示，柞蠶ApMLEC可能同樣參與内質網糖蛋白的品質控制，幹擾内質網出現的正在發生糖基化修飾的病毒糖蛋白，抑制病毒的複制表達。
目前，抑制ER病毒糖蛋白折疊機制是開發部分抗病毒藥物的政策之一，已有通過亞氨基糖競争性抑制葡萄糖苷酶I和II，進而抑制新生糖蛋白，進而阻斷絲狀病毒糖蛋白折疊的研究。
是以，以上實驗結果說明對ApMLEC免疫潛能的進一步探索有利于更好地認識柞蠶免疫。
| ApMLEC品質濃度 Mass concentration of ApMLEC/(μg/mL) | 抑制區直徑 Diameter of suppression zone/mm | |
| E.coli | S.aureus | |
| 250 | 14.23±0.21** | 18.10±0.10** |
| 500 | 17.53±0.32** | 21.20±0.26** |
| 1 000 | 20.53±0.15** | 26.40±0.10** |
| Kana(10 mg/mL) | 26.47±0.45 | 30.27±0.25 |
| PBS | — | — |
ApMLEC對細菌的抑制
| 細菌 Bacteria | ApMLEC品質濃度Mass concentration of ApMLEC/(μg/mL) | |||||
| 125 | 250 | 500 | 1 000 | Kana | PBS | |
| E.coli | - | + | + | + | + | - |
| S.aureus | - | + | + | + | + | - |
注：“-”表示對細菌無抑制作用；“+”表示對細菌有抑制作用。
本研究通過大腸杆菌表達系統成功純化ApMLEC，初步探究其結合麥芽糖配體的生物學活性，以及結合和抑制多種細菌的能力，也進一步驗證了内源性ApMLEC對ApNPV病毒的抑制作用。
綜上所述，ApMLEC可能在柞蠶先天免疫中發揮重要作用，研究結果為預防柞蠶感病提供新的思路和方法。