今日推送的文章是发表在Food Chemistry的“Purification and characterization of the enzymes from Brevundimonas naejangsanensis that degrade ochratoxin A and B”，通讯作者为中国农业大学食品科学与营养工程学院的梁志宏副教授。
1
(NH4)2SO4 盐析纯化
用(NH4)2SO4盐析蛋白质可以大大减少溶液体积，同时保留了蛋白质的生物活性，因此常用于蛋白质纯化的第一步。首先通过盐析提取ML17菌株胞外代谢产物中的OTA降解酶。(NH4)2SO4饱和度为20%、40%、60%和80%盐析出的蛋白质具有OTA降解活性（图1）。主要降解酶可被80%饱和度的(NH4)2SO4盐析出。为了获得更多的活性成分，后续的纯化工作使用饱和度为80%的(NH4)2SO4来浓缩OTA降解酶。该步骤使粗酶体积减少约16倍，降解酶纯化5.1倍，产率18.9%。
图1
2
HIC 纯化
HIC 在特定条件下根据蛋白质的疏水系数来分离不同的蛋白质。大多数蛋白质在高离子浓度下被HIC的疏水配体吸附，并在低离子溶液中洗脱。纯化的第二步是使用 HIC 纯化 OTA 降解酶。如图2A和B所示，OTA降解酶集中在100 mmol/L (NH4)2SO4的洗脱峰上。不同洗脱组分的蛋白质差异较大，表明它们分离良好（图2C）。3-7 级分具有最强的 OTA 降解活性，并且在 50 和 70 kDa 附近具有相同的条带，这可能是 OTA 降解酶（图2 B 和 C）。HIC 纯化步骤使粗酶溶液的尺寸减小了约 3.4 倍，纯化倍数为 7.2，产率为 9.2%。
图2
3
两次hrCNE纯化
hrCNE 根据蛋白质的电荷和分子量来分离蛋白质，同时保留蛋白质的生物活性。下一个纯化步骤是使用两次 hrCNE 来纯化 OTA 降解酶。在第 1 次 hrCNE 中，将标记泳道和其中一个样品泳道的凝胶切下并染色以进行观察（图 3A）。蛋白质在 hrCNE 凝胶中得到很好的分离。然后将样品凝胶从上到下切成6等份，通过电泳洗脱回收凝胶中的蛋白质。如图3B和C所示，从第一三块凝胶中回收的蛋白质具有OTA降解活性，并且这些成分在440kDa标记周围有共同的条带，这可能是OTA降解酶的位置。从第一个 hrCNE 的条带 2 回收的蛋白质进行第二个 hrCNE。与第1次hrCNE类似，第2次hrCNE的凝胶被分成5等份，然后回收蛋白质。从第二次hrCNE的条带1和2中回收的蛋白质具有更好的OTA降解活性（图3F）。从hrCNE（图3D）和SDS-PAGE（图3E）的电泳图可以发现，经过第2次hrCNE后，降解酶成分比较纯净。
通过质谱法鉴定从第二次 hrCNE 的条带 1 和 2 回收的蛋白质。据报道，具有OTA降解活性的酶主要包括羧肽酶和酰胺水解酶。回收的蛋白中有四种潜在的OTA降解酶，分别属于M3家族肽酶（基因0095编码）、丝氨酸羧肽酶（基因1826编码）、M14家族金属肽酶（基因2253编码）和酰胺水解酶家族蛋白（基因0484编码）。这四种酶被命名为BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3和BnOTAase4，分子量分别为79.7、58.4、67.7和45.8 kDa。这四种酶的氨基酸序列与报道的 OTA 降解酶进行 BLAST 比对，其中包括来自牛的羧肽酶、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和溶杆菌，以及来自黑曲霉、粪产碱菌和寡养单胞菌的酰胺酶。四种酶的氨基酸序列与已发现的OTA降解酶的同一性均小于25%，表明这些酶是新型潜在的OTA降解酶。
图3
4
降解酶的重组表达
在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中表达四种潜在的OTA降解酶的基因，以验证其OTA和OTB降解活性。如图4所示，经SDS-PAGE（图4A）和Western blot（图4B）检测，目的基因成功表达。BnOTAase1、BnOTAase2和BnOTAase3在细胞中主要以可溶性表达。BnOTAase4 在细胞内可溶体和包涵体中表达。这些酶通过镍亲和层析纯化，获得具有近似理论分子量的产物（图4C）。
图4
5
重组酶的 OTA 和 OTB 降解活性
重组酶对 OTA 和 OTB 的降解率BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3 和 BnOTAase4 通过 HPLC 测定。OTA、OTα、OTB 和 OTβ 标准品的保留时间（RT）分别为 4.270、3.427、3.443 和 2.899 分钟（图 5A 和 B）。在重组酶与OTA或OTB的反应体系中检测到各自的产物，其色谱图与标准品相似或相同。这四种重组酶分别将OTA和OTB降解为OTα和OTβ，降解率为100%。重组酶水解OTA和OTB降解产物的RT与CPA相同，表明重组酶和CPA与OTA和OTB具有相似的降解机制。即，OTA和OTB的酰胺键被水解（图5B）。
水解OTA或OTB的重组酶的米氏常数Km通过双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图)测定。以OTA为底物，BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3、BnOTAase4的Km值分别为19.38、0.92、12.11、1.09 μmol/L。以OTB为底物时，这四种重组酶的Km值分别为0.76、2.43、0.60和0.64 μmol/L。
图5
5
OTA和OTB降解产物的细胞毒性
为了确定OTA和OTB的降解产物（OTα和OTβ）的毒性是否正在减轻，本研究检测了OTA、OTB及其降解产物对HEK293的细胞增殖毒性、凋亡率和细胞周期阻滞效应。细胞暴露于OTA和/或OTB（0-30μmol/L）会导致细胞活力出现浓度依赖性下降，并且它们的降解产物在试验浓度内对HEK293细胞系没有增殖毒性（图6A）。培养基对照（CK）、OTA、OTB以及OTA和OTB联合处理组的细胞凋亡率分别为4.21±0.06%、20.66±0.50%、17.44±0.21%和20.14±0.06%（图6B）。降解产物的处理组对细胞凋亡率没有显着影响。OTA 和 OTB 联合治疗显着改变了细胞周期。G0/G1期细胞比例下降至对照组的77.08%，S期和G2/M期细胞比例分别增加1.15倍和3.48倍，提示细胞周期停滞在S期和G2/M 期（图 6C）。降解产物的处理组没有显着改变HEK293的细胞周期进程。以上结果表明OTA和OTB的降解产物对HEK293细胞系的毒性较小。
图6
在动物、植物、细菌和真菌中发现了降解 OTA 的酶，包括羧肽酶、酰胺酶、过氧化物酶、蛋白酶A等，表明降解OTA的酶在生物体内广泛存在。尽管已发现许多细菌具有OTA降解活性，但仅发现了少数源自细菌的降解酶。这限制了微生物资源的利用。之前发现了一种可以水解 OTA 和 OTB 的细菌菌株 ML17。本研究从ML17菌株胞外代谢物中纯化出潜在的OTA和OTB降解酶，并通过在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中重组表达验证了这些酶的降解活性，并评价了ML17菌株降解产物的细胞毒性。根据蛋白质的特性组合多种纯化方法是发现新型霉菌毒素解毒酶的有效策略，例如黄曲霉毒素B1解毒酶FAO的发现和玉米赤霉烯酮解毒酶ZHD101的发现。盐析是粗分离阶段常用的方法。OTA 降解组分分散在 20-80% 的 (NH4)2SO4 饱和度中（图 1），表明 OTA 降解酶可能是多组分的。在中等纯化阶段，经常使用疏水或离子交换色谱。但离子交换色谱要求样品保持较低的初始离子浓度（一般小于20mmol/L），因此样品需要进行透析或其他脱盐处理。如果在此阶段通过 HIC 纯化蛋白质，则无需脱盐。该过程中OTA降解组分的纯化倍数为7.2倍，表明HIC适合纯化OTA降解酶。在精细纯化阶段，作者通过hrCNE对OTA降解酶进行纯化，并在回收的活性成分中鉴定出四种潜在的OTA降解酶。
通过在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中重组表达，作者验证了这四种酶具有OTA和OTB降解活性。这些酶的分子量分别为 79.7、58.4、67.7 和 45.8 kDa，分别命名为 BnOTase1、BnOTase2、BnOTase3 和 BnOTase4。BnOTase1、BnOTase2 和 BnOTase3 属于肽酶，BnOTase4 属于酰胺酶。这四种酶与已发现的OTA降解酶的氨基酸序列一致性小于25%，表明这些酶是新型OTA降解酶。四种降解酶的OTA降解率为100%，高于已报道的细菌羧肽酶DacA、DacB和DacC 。曾有报道一种酰胺水解酶，即ADH3，可以在90秒内完全降解50 ng/mL OTA。这是目前已报道的OTA降解活性最强的酶。尽管本文报道的OTA降解酶活性低于ADH3，但为进一步探索OTA降解机制提供了材料。
据报道，能够降解 OTB 的酶相对较少。据报道，CPA 可以降低 OTA 和 OTB 的性能。OTA和OTB均可被BnOTase1、BnOTase2、BnOTase3、BnOTase4完全降解，其降解机理与CPA相同，即分子中酰胺键的水解。这表明由于 OTA 和 OTB 之间的结构相似性，降解 OTA 的酶也可能降解 OTB。
大多数赭曲霉毒素，如 OTA、OTB、OTC、4-OH OTA、4-OH OTB 和 10-OH OTA 的分子中都含有酰胺键这些毒素很可能被发现的酰胺键水解。OTA 降解酶可能有助于减轻食品和饲料中多种赭曲霉毒素的共同污染。OTA会引起氧化应激，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并阻断细胞或动物细胞周期的正常过程。其主要毒性机制在于分子中的苯丙氨酸残基。
因此，OTA的酰胺键水解生成OTα和phe是一条重要的解毒途径。早期毒理学研究表明OTα的毒性低于OTA。例如，BALB/c小鼠在腹腔注射1μg/kg剂量后没有表现出免疫毒性。OTα 的消除半衰期，大鼠体内 OTα 的消除半衰期为 9.6 小时，约为 OTA（103 小时）的十分之一。OTβ 没有毒理学数据。OTA或OTB的酰胺键可被ML17菌株及其代谢产物水解成OTα或OTβ。OTA和OTB对HEK293细胞具有显着的细胞毒性，即抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。
细胞凋亡，并阻止细胞周期（图6）。它们的降解产物 OTα 和 OTβ 在试验浓度内没有表现出明显的细胞毒性。这表明本研究中确定的四种降解酶可以减轻OTA和OTB的细胞毒性。然而，本研究仅初步评估了OTα和OTβ的细胞毒性，仍需要在动物水平上进行更广泛 的安全性评价工作。
综上，作者发现了四种新型赭曲霉毒素降解酶，其解毒机制与CPA类似，即它们可以分别将OTA和OTB水解成低毒性产物OTα和OTβ。这些酶的氨基酸序列与已报道的OTA解毒酶的一致性小于25%，表明具有新颖性。虽然解毒活性不如酰胺酶ADH3，但其对OTA和OTB的降解率均达到100%。由于OTA降解酶也具有降解OTB的功能，基于赭曲霉毒素结构的相似性，有可能联合多种赭曲霉毒素解毒用于去除食品和饲料中多种赭曲霉毒素的酶。
文章信息：
DOI：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135926