今日推送的文章是發表在Food Chemistry的“Purification and characterization of the enzymes from Brevundimonas naejangsanensis that degrade ochratoxin A and B”，通訊作者為中國農業大學食品科學與營養工程學院的梁志宏副教授。
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(NH4)2SO4 鹽析純化
用(NH4)2SO4鹽析蛋白質可以大大減少溶液體積，同時保留了蛋白質的生物活性，是以常用于蛋白質純化的第一步。首先通過鹽析提取ML17菌株胞外代謝産物中的OTA降解酶。(NH4)2SO4飽和度為20%、40%、60%和80%鹽析出的蛋白質具有OTA降解活性（圖1）。主要降解酶可被80%飽和度的(NH4)2SO4鹽析出。為了獲得更多的活性成分，後續的純化工作使用飽和度為80%的(NH4)2SO4來濃縮OTA降解酶。該步驟使粗酶體積減少約16倍，降解酶純化5.1倍，産率18.9%。
圖1
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HIC 純化
HIC 在特定條件下根據蛋白質的疏水系數來分離不同的蛋白質。大多數蛋白質在高離子濃度下被HIC的疏水配體吸附，并在低離子溶液中洗脫。純化的第二步是使用 HIC 純化 OTA 降解酶。如圖2A和B所示，OTA降解酶集中在100 mmol/L (NH4)2SO4的洗脫峰上。不同洗脫組分的蛋白質差異較大，表明它們分離良好（圖2C）。3-7 級分具有最強的 OTA 降解活性，并且在 50 和 70 kDa 附近具有相同的條帶，這可能是 OTA 降解酶（圖2 B 和 C）。HIC 純化步驟使粗酶溶液的尺寸減小了約 3.4 倍，純化倍數為 7.2，産率為 9.2%。
圖2
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兩次hrCNE純化
hrCNE 根據蛋白質的電荷和分子量來分離蛋白質，同時保留蛋白質的生物活性。下一個純化步驟是使用兩次 hrCNE 來純化 OTA 降解酶。在第 1 次 hrCNE 中，将标記泳道和其中一個樣品泳道的凝膠切下并染色以進行觀察（圖 3A）。蛋白質在 hrCNE 凝膠中得到很好的分離。然後将樣品凝膠從上到下切成6等份，通過電泳洗脫回收凝膠中的蛋白質。如圖3B和C所示，從第一三塊凝膠中回收的蛋白質具有OTA降解活性，并且這些成分在440kDa标記周圍有共同的條帶，這可能是OTA降解酶的位置。從第一個 hrCNE 的條帶 2 回收的蛋白質進行第二個 hrCNE。與第1次hrCNE類似，第2次hrCNE的凝膠被分成5等份，然後回收蛋白質。從第二次hrCNE的條帶1和2中回收的蛋白質具有更好的OTA降解活性（圖3F）。從hrCNE（圖3D）和SDS-PAGE（圖3E）的電泳圖可以發現，經過第2次hrCNE後，降解酶成分比較純淨。
通過質譜法鑒定從第二次 hrCNE 的條帶 1 和 2 回收的蛋白質。據報道，具有OTA降解活性的酶主要包括羧肽酶和酰胺水解酶。回收的蛋白中有四種潛在的OTA降解酶，分别屬于M3家族肽酶（基因0095編碼）、絲氨酸羧肽酶（基因1826編碼）、M14家族金屬肽酶（基因2253編碼）和酰胺水解酶家族蛋白（基因0484編碼）。這四種酶被命名為BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3和BnOTAase4，分子量分别為79.7、58.4、67.7和45.8 kDa。這四種酶的氨基酸序列與報道的 OTA 降解酶進行 BLAST 比對，其中包括來自牛的羧肽酶、解澱粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和溶杆菌，以及來自黑曲黴、糞産堿菌和寡養單胞菌的酰胺酶。四種酶的氨基酸序列與已發現的OTA降解酶的同一性均小于25%，表明這些酶是新型潛在的OTA降解酶。
圖3
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降解酶的重組表達
在大腸杆菌BL21（DE3）菌株中表達四種潛在的OTA降解酶的基因，以驗證其OTA和OTB降解活性。如圖4所示，經SDS-PAGE（圖4A）和Western blot（圖4B）檢測，目的基因成功表達。BnOTAase1、BnOTAase2和BnOTAase3在細胞中主要以可溶性表達。BnOTAase4 在細胞内可溶體和包涵體中表達。這些酶通過鎳親和層析純化，獲得具有近似理論分子量的産物（圖4C）。
圖4
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重組酶的 OTA 和 OTB 降解活性
重組酶對 OTA 和 OTB 的降解率BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3 和 BnOTAase4 通過 HPLC 測定。OTA、OTα、OTB 和 OTβ 标準品的保留時間（RT）分别為 4.270、3.427、3.443 和 2.899 分鐘（圖 5A 和 B）。在重組酶與OTA或OTB的反應體系中檢測到各自的産物，其色譜圖與标準品相似或相同。這四種重組酶分别将OTA和OTB降解為OTα和OTβ，降解率為100%。重組酶水解OTA和OTB降解産物的RT與CPA相同，表明重組酶和CPA與OTA和OTB具有相似的降解機制。即，OTA和OTB的酰胺鍵被水解（圖5B）。
水解OTA或OTB的重組酶的米氏常數Km通過雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk作圖)測定。以OTA為底物，BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3、BnOTAase4的Km值分别為19.38、0.92、12.11、1.09 μmol/L。以OTB為底物時，這四種重組酶的Km值分别為0.76、2.43、0.60和0.64 μmol/L。
圖5
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OTA和OTB降解産物的細胞毒性
為了确定OTA和OTB的降解産物（OTα和OTβ）的毒性是否正在減輕，本研究檢測了OTA、OTB及其降解産物對HEK293的細胞增殖毒性、凋亡率和細胞周期阻滞效應。細胞暴露于OTA和/或OTB（0-30μmol/L）會導緻細胞活力出現濃度依賴性下降，并且它們的降解産物在試驗濃度内對HEK293細胞系沒有增殖毒性（圖6A）。培養基對照（CK）、OTA、OTB以及OTA和OTB聯合處理組的細胞凋亡率分别為4.21±0.06%、20.66±0.50%、17.44±0.21%和20.14±0.06%（圖6B）。降解産物的處理組對細胞凋亡率沒有顯着影響。OTA 和 OTB 聯合治療顯着改變了細胞周期。G0/G1期細胞比例下降至對照組的77.08%，S期和G2/M期細胞比例分别增加1.15倍和3.48倍，提示細胞周期停滞在S期和G2/M 期（圖 6C）。降解産物的處理組沒有顯着改變HEK293的細胞周期程序。以上結果表明OTA和OTB的降解産物對HEK293細胞系的毒性較小。
圖6
在動物、植物、細菌和真菌中發現了降解 OTA 的酶，包括羧肽酶、酰胺酶、過氧化物酶、蛋白酶A等，表明降解OTA的酶在生物體内廣泛存在。盡管已發現許多細菌具有OTA降解活性，但僅發現了少數源自細菌的降解酶。這限制了微生物資源的利用。之前發現了一種可以水解 OTA 和 OTB 的細菌菌株 ML17。本研究從ML17菌株胞外代謝物中純化出潛在的OTA和OTB降解酶，并通過在大腸杆菌BL21(DE3)菌株中重組表達驗證了這些酶的降解活性，并評價了ML17菌株降解産物的細胞毒性。根據蛋白質的特性組合多種純化方法是發現新型黴菌毒素解毒酶的有效政策，例如黃曲黴毒素B1解毒酶FAO的發現和玉米赤黴烯酮解毒酶ZHD101的發現。鹽析是粗分離階段常用的方法。OTA 降解組分分散在 20-80% 的 (NH4)2SO4 飽和度中（圖 1），表明 OTA 降解酶可能是多組分的。在中等純化階段，經常使用疏水或離子交換色譜。但離子交換色譜要求樣品保持較低的初始離子濃度（一般小于20mmol/L），是以樣品需要進行透析或其他脫鹽處理。如果在此階段通過 HIC 純化蛋白質，則無需脫鹽。該過程中OTA降解組分的純化倍數為7.2倍，表明HIC适合純化OTA降解酶。在精細純化階段，作者通過hrCNE對OTA降解酶進行純化，并在回收的活性成分中鑒定出四種潛在的OTA降解酶。
通過在大腸杆菌BL21（DE3）菌株中重組表達，作者驗證了這四種酶具有OTA和OTB降解活性。這些酶的分子量分别為 79.7、58.4、67.7 和 45.8 kDa，分别命名為 BnOTase1、BnOTase2、BnOTase3 和 BnOTase4。BnOTase1、BnOTase2 和 BnOTase3 屬于肽酶，BnOTase4 屬于酰胺酶。這四種酶與已發現的OTA降解酶的氨基酸序列一緻性小于25%，表明這些酶是新型OTA降解酶。四種降解酶的OTA降解率為100%，高于已報道的細菌羧肽酶DacA、DacB和DacC 。曾有報道一種酰胺水解酶，即ADH3，可以在90秒内完全降解50 ng/mL OTA。這是目前已報道的OTA降解活性最強的酶。盡管本文報道的OTA降解酶活性低于ADH3，但為進一步探索OTA降解機制提供了材料。
據報道，能夠降解 OTB 的酶相對較少。據報道，CPA 可以降低 OTA 和 OTB 的性能。OTA和OTB均可被BnOTase1、BnOTase2、BnOTase3、BnOTase4完全降解，其降解機理與CPA相同，即分子中酰胺鍵的水解。這表明由于 OTA 和 OTB 之間的結構相似性，降解 OTA 的酶也可能降解 OTB。
大多數赭曲黴毒素，如 OTA、OTB、OTC、4-OH OTA、4-OH OTB 和 10-OH OTA 的分子中都含有酰胺鍵這些毒素很可能被發現的酰胺鍵水解。OTA 降解酶可能有助于減輕食品和飼料中多種赭曲黴毒素的共同污染。OTA會引起氧化應激，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并阻斷細胞或動物細胞周期的正常過程。其主要毒性機制在于分子中的苯丙氨酸殘基。
是以，OTA的酰胺鍵水解生成OTα和phe是一條重要的解毒途徑。早期毒理學研究表明OTα的毒性低于OTA。例如，BALB/c小鼠在腹腔注射1μg/kg劑量後沒有表現出免疫毒性。OTα 的消除半衰期，大鼠體内 OTα 的消除半衰期為 9.6 小時，約為 OTA（103 小時）的十分之一。OTβ 沒有毒理學資料。OTA或OTB的酰胺鍵可被ML17菌株及其代謝産物水解成OTα或OTβ。OTA和OTB對HEK293細胞具有顯着的細胞毒性，即抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。
細胞凋亡，并阻止細胞周期（圖6）。它們的降解産物 OTα 和 OTβ 在試驗濃度内沒有表現出明顯的細胞毒性。這表明本研究中确定的四種降解酶可以減輕OTA和OTB的細胞毒性。然而，本研究僅初步評估了OTα和OTβ的細胞毒性，仍需要在動物水準上進行更廣泛 的安全性評價工作。
綜上，作者發現了四種新型赭曲黴毒素降解酶，其解毒機制與CPA類似，即它們可以分别将OTA和OTB水解成低毒性産物OTα和OTβ。這些酶的氨基酸序列與已報道的OTA解毒酶的一緻性小于25%，表明具有新穎性。雖然解毒活性不如酰胺酶ADH3，但其對OTA和OTB的降解率均達到100%。由于OTA降解酶也具有降解OTB的功能，基于赭曲黴毒素結構的相似性，有可能聯合多種赭曲黴毒素解毒用于去除食品和飼料中多種赭曲黴毒素的酶。
文章資訊：
DOI：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135926