文|探墓秘史
编辑|探墓秘史
前言
将大气中的二氮生物固定为氨对海洋初级生产的范围具有重大影响 。已知只有少数细菌有助于开放海洋环境中的固氮作用，并且它们通常只占整个微生物群落的一小部分 (< 0.1%)。
其中，估计单细胞固氮菌Crocosphaera watsonii是海洋固氮的重要贡献者。预计热带和亚热带海洋地区的大部分初级生产力受氮限制，而重氮生物的氮源由大型大气水库补给，基本上是无限的。
相反，铁被认为是海洋固氮菌的关键微量营养素，因为它们使用铁固氮酶蛋白复合物，该复合物包含具有 4Fe∶4S 金属簇 (NifH) 的同二聚体铁蛋白和具有 8Fe∶7S P 簇的异四聚体钼铁蛋白和 7 Fe 和 1 Mo MoFe 辅助因子（NifDK、α 和 β 亚基）。
野外实验和模型都预测海洋固氮的分布主要受铁可用性的限制。尽管铁对海洋固氮作用如此重要，但人们对海洋固氮菌如何适应这种低铁环境的了解有限。
由于对铁的高需求以及分子氧和固氮酶蛋白复合物的化学不相容性，含氧光合作用和固氮代谢的共存对固氮菌提出了独特的挑战，以前测量鳄鱼全细胞铁含量的元素研究发现，在固氮发生的黑暗时期铁含量增加。
尽管这一发现与预测海洋固氮菌需要大量铁的理论研究一致，但由于对细胞内铁的动态但知之甚少的昼夜循环的影响，它一直存在一些争议。
几种单细胞固氮菌，包括Crocosphaera watsonii, 已经观察到在黑暗时期固定氮, 这被广泛认为是对光合作用和固氮的时间分离的适应, 以避免固氮酶复合物的氧气破坏。
全球转录研究还观察到单细胞固氮菌Crocosphaera watsonii 、Cyanothece、Gloeothece和温泉聚球藻 ( Synechococcus)的转录组的大规模变化在昼夜循环期间，与光合作用和固氮作用的时间分离一致。
然而，转录组或蛋白质组的昼夜循环可能影响铁需求的可能性以前并未讨论过，可能是因为转录研究提供了有关基因表达的信息，而不是迄今为止的实际酶库存和免疫学蛋白质研究。
同时检测到Crocosphaera和Gloeothece中的 NifH 亚基，仅限于一些选定的蛋白质，目前还没有发表关于固氮菌的全球或绝对定量蛋白质组研究。
因此，仍然不确定观察到的昼夜转录组循环是否需要维持相对一致的蛋白质组，或者实际上在每个昼夜循环期间导致全球蛋白质组组成发生巨大变化。
蛋白质组学技术的最新进展有望阐明重要微生物的生物化学与全球生物地球化学循环之间的机制联系，基于质谱的蛋白质组学有两种广泛的方法：全局鸟枪法蛋白质组学方法。
可以使用光谱计数同时半定量调查数百种蛋白质的相对丰度，以及使用选择反应监测 (SRM) 质谱法和同位素标记的靶向方法用于对感兴趣的蛋白质进行绝对定量的肽标准 。
尽管有几项基于培养的海洋微生物研究和丰富蛋白质的实地评估, 全球和有针对性的蛋白质组学方法联合应用于海洋生物地球化学相关问题, 例如海洋重氮营养的铁限制, 尚未见报道。
结果与讨论
Crocosphaera watsonii中铁金属酶的昼夜循环和库存使用全局和靶向液相色谱质谱 (LC-MS) 蛋白质组学技术从三个不同的培养实验中进行了研究。
这些实验均在 14∶10 光照∶黑暗循环中生长：在光照和黑暗光周期期间采样的昼夜实验（采样 10 小时）从开灯开始和关灯 7 小时）使用一维和二维 LC-MS 方法分析全局蛋白质组。
时间过程研究（此处为 diel）每 2-3 小时采样一次，持续 30 小时（从开灯开始 4 小时）和使用 1D LC-MS 分析全局蛋白质组和目标蛋白质的绝对数量。
以及一组生物一式三份培养物（在光照期 6.5 小时取样，在黑暗期取样 3 小时和 6 小时）通过质谱法分析目标蛋白质丰度。
在昼夜实验的全局蛋白质组学一维分析中鉴定的 477 种独特蛋白质中 [0.65% 假阳性率 (FPR)]，发现 37 种蛋白质在一天之间的丰度变化为 2 倍或更大和夜晚。
这些结果在更深的 2D 层析蛋白质组中得到证实，其中 1,108 种已鉴定蛋白质中的 160 种 (0.11% FPR) 显示出大于 2 倍的变化。昼夜循环的时间过程清楚地显示了蛋白质丰度的循环。
光照影响
其中 100 种蛋白质被发现高于阈值光谱计数信号 (≥10) 并显示振幅的昼夜变化 (最大 - 最小 ≥14)聚类分析揭示了两大类，其中包括关键的光系统或固氮蛋白，它们分别在白天和夜间增加了丰度。
这些实验表明，在单细胞固氮菌的转录组中观察到的昼夜循环在全局蛋白质组中表现出大规模变化，其中昼夜实验中超过 20% 的测量蛋白质显示昼夜变化。
在昼夜和昼夜实验中，参与固氮的金属酶在Crocosphaera watsonii是丰度变化最显着的那些，白天基本不存在，晚上出现。
基于这些全局实验，使用同位素标记的内标通过三重四极杆 SRM 质谱法测定了 diel 实验中九个蛋白质靶标的绝对丰度。
三种固氮酶金属蛋白的丰度范围从光周期期间的不可检测水平到黑暗时期蛋白质组中最丰富的蛋白质之一。
在其丰度峰值时，铁蛋白与钼铁蛋白亚基（此处使用的α）的比率为 3.5∶1，这与先前观察到的 3∶1 细胞比率和固氮酶内 2∶1 的化学计量一致蛋白质复合物。
这些全局和有针对性的蛋白质组测量一起为固氮酶复合物中金属酶的夜间合成以及随后的完全昼夜降解提供了证据。
观察到黄素氧还蛋白在黑暗时期的丰度增加，类似于固氮酶金属酶，并且与在缺铁条件下在大多数浮游植物中观察到的黄素氧还素丰度增加形成对比。
这表明铁氧还蛋白-黄素还蛋白替代光合作用中的电子传递在鳄鱼目中没有明显发生，在光照期间对短期铁剥夺实验的全局蛋白质组进行采样，以区分铁效应和暗表达。
蛋白影响
在添加外源性铁载体后 24 小时，未观察到黄素氧还蛋白响应铁胁迫而增加，这与黄素氧还蛋白可以作为固氮酶而不是铁氧还蛋白的电子载体的假设一致。
即使在铁充足的条件下，在夜间使用黄素氧还蛋白似乎是对这种微生物细胞铁需求整体最小化的一种适应。
在固氮酶金属酶和黄素氧还蛋白的镜像中，许多蛋白质在光周期期间更丰富，特别是，来自富含铁的光系统 I 的几种蛋白质在黑暗时期减少，在光照时期增加。
包括 PsaA、PsaB、PsaD 和 PsaF。含铁细胞色素 b6 和 c550 是通过光谱计数检测到的最丰富的细胞色素之一（还检测到 f、P450 和 b559 和 c 氧化酶），
并且通过靶向质谱法测量在黑暗时期丰度大幅下降。大量细胞色素 b6 和 c550 的降解会在黑暗时期释放出大量含铁血红素。在蛋白质组中鉴定出两种能够从血红素中释放铁的血红素加氧酶，
它们显示出昼夜变化，并且可能在铁循环中很重要。在蛋白质组中也鉴定出储铁细菌铁蛋白，其中之一显示出一定的昼夜周期性。考虑到铁被认为是在不降解的情况下从铁蛋白笼中添加和去除的，因此对于细菌铁蛋白不一定会出现昼夜循环。
转录和免疫学
这些结果描绘了一个动态的Crocosphaera蛋白质组，改变其金属酶库存以适应固氮和光合生化活动的交替时间需求。尽管Crocosphaera独特的夜间固氮酶活性是其在实验室和野外研究中的决定性特征之一，
但由于转录和免疫学方法的技术限制，固氮酶蛋白复合物在光照期间的命运仍存在争议, 其中转录本不测量蛋白质丰度，免疫学方法可能无法检测翻译后修饰的蛋白质。
通过对每种蛋白质的多种胰蛋白酶肽进行质谱分析，本研究表明固氮酶复合物中的金属酶几乎完全降解，光合作用的某些含铁成分部分降解。考虑到潜在的显着能量成本，
我们在Crocosphaera watsonii中观察到的蛋白质组循环的程度令人惊讶。如前所述，这种蛋白质组循环可能具有防止氧气破坏固氮酶复合物的双重功能，以及提供显着减少代谢铁需求的机制。
我们认为后者是正确的，基于A - H中定量金属酶数据的化学计量计算以及每种金属酶的相关铁化学计量。通过总结与主要金属酶相关的铁，我们计算了整个昼夜循环中参与固氮和光合作用的铁量。
通过在不使用时降解这些金属酶，Crocosphaera与这些金属酶未降解的假设情况相比，在任何给定时间，峰值夜间、峰值日和最小值的铁金属酶库存分别减少了 38%、40% 和 75%。
固氮和光合作用
对生物一式三份进行靶向蛋白质分析的另一项实验与昼夜实验中铁守恒的这些估计一致，在光周期（开灯后 6.5 小时，n = 3）期间使用的铁减少了 45 ± 19%，以及 38 ± 14 %在黑暗时期减少 38 ± 22% 的铁（在熄灯后 3 小时和 6 小时采样， 每个n = 3）。
如果在黑暗时期观察到不含铁的黄素氧还蛋白，那么这些铁用量的节省会更大被需要铁的铁氧还蛋白取代。这些金属酶降解释放的铁可能有几种命运，
包括储存在细菌铁蛋白或伴侣蛋白中、从细胞中损失以及在其他金属酶中重新使用。考虑到上层海洋严重的铁限制条件，似乎有一部分释放出来的铁存量参与了固氮和光合作用代谢过程。
这种铁保护策略类似于 hotbunking 的海上实践，指的是航行时搭载的水手（金属酶需求）多于铺位（铁原子）的船只，相反轮班的水手共享同一个铺位——保持铺位持续热（或铁使用中的原子）。
虽然在方法学上很难记录代谢之间共享单个铁原子，但我们的数据清楚地证明了通过昼夜蛋白质组循环减少铁金属酶库存和同时减少代谢铁需求。
通过减少金属酶库存来保存铁可能是鳄鱼目低铁海洋生态位的关键组成部分。毛霉属 是另一种占主导地位的含氧海洋固氮菌，它不同于鳄球藻，因为它在光周期中同时固定氮和碳。
结果是Trichodesmium sp。可能不会像Crocosphaera那样采用这种铁保护策略。这与Trichodesmium与Crocosphaera（> 35 和 16 ± 11 μ分别为mol Fe mol C -1 )，以及对Trichodesmium中固氮所需的大部分细胞铁 (22–50%) 的估计。
先前对Crocosphaera watsonii细胞铁的研究观察到在黑暗时期每个细胞的铁浓度增加。我们计算出的每个细胞的铁含量归因于固氮和光合作用与测量值大致一致，
夜间较高的铁含量可能是昼夜蛋白质组循环的结果，加上白天亚铁的吸收和积累由光化学还原和光周期细胞分裂产生。
金属酶的库存
通过减少不使用时的固氮和光合金属酶库存，Crocosphaera watsonii已经进化为比在整个昼夜循环中维持这些酶少 40% 的铁。虽然难以量化，但这种每天重新合成酶的过程肯定会消耗大量精力。
根据我们的定量测量，仅三种固氮酶金属蛋白的昼夜循环就贡献了总蛋白质的～2.3%，图 3 中的所有八种靶蛋白贡献了 5.0%（使用昼夜循环期间最大和最小表达水平之间的差异）。
许多较低丰度的蛋白质也经历昼夜循环, 并且蛋白质贡献了大约 40% 的细胞生物量, 这些计算提供了一些粗略的能量成本, 以增加蛋白质合成所需的能量成本,
从而减少铁代谢需求 (此处称为“hotbunking”)。如果Crocosphaera watsonii从一个通过昼夜维持其金属酶的祖先进化出 hotbunking，那么较低的铁需求和较高的能量成本之间的权衡将如何影响Crocosphaera相对于其祖先和其他固氮菌的竞争力？
一个数值全球海洋环流和生态系统模型是一个有用的工具来探索 hotbunking 对Crocosphera的影响全球海洋的栖息地和固氮率。
结语
通过此次研究我们可以发现，减少固氮菌中的金属酶之后，铁被腐蚀的速率变小，这个方法完全可以用来保护铁。
参考文献：
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