文|探墓秘史
編輯|探墓秘史
前言
将大氣中的二氮生物固定為氨對海洋初級生産的範圍具有重大影響 。已知隻有少數細菌有助于開放海洋環境中的固氮作用，并且它們通常隻占整個微生物群落的一小部分 (< 0.1%)。
其中，估計單細胞固氮菌Crocosphaera watsonii是海洋固氮的重要貢獻者。預計熱帶和亞熱帶海洋地區的大部分初級生産力受氮限制，而重氮生物的氮源由大型大氣水庫補給，基本上是無限的。
相反，鐵被認為是海洋固氮菌的關鍵微量營養素，因為它們使用鐵固氮酶蛋白複合物，該複合物包含具有 4Fe∶4S 金屬簇 (NifH) 的同二聚體鐵蛋白和具有 8Fe∶7S P 簇的異四聚體钼鐵蛋白和 7 Fe 和 1 Mo MoFe 輔助因子（NifDK、α 和 β 亞基）。
野外實驗和模型都預測海洋固氮的分布主要受鐵可用性的限制。盡管鐵對海洋固氮作用如此重要，但人們對海洋固氮菌如何适應這種低鐵環境的了解有限。
由于對鐵的高需求以及分子氧和固氮酶蛋白複合物的化學不相容性，含氧光合作用和固氮代謝的共存對固氮菌提出了獨特的挑戰，以前測量鳄魚全細胞鐵含量的元素研究發現，在固氮發生的黑暗時期鐵含量增加。
盡管這一發現與預測海洋固氮菌需要大量鐵的理論研究一緻，但由于對細胞内鐵的動态但知之甚少的晝夜循環的影響，它一直存在一些争議。
幾種單細胞固氮菌，包括Crocosphaera watsonii, 已經觀察到在黑暗時期固定氮, 這被廣泛認為是對光合作用和固氮的時間分離的适應, 以避免固氮酶複合物的氧氣破壞。
全球轉錄研究還觀察到單細胞固氮菌Crocosphaera watsonii 、Cyanothece、Gloeothece和溫泉聚球藻 ( Synechococcus)的轉錄組的大規模變化在晝夜循環期間，與光合作用和固氮作用的時間分離一緻。
然而，轉錄組或蛋白質組的晝夜循環可能影響鐵需求的可能性以前并未讨論過，可能是因為轉錄研究提供了有關基因表達的資訊，而不是迄今為止的實際酶庫存和免疫學蛋白質研究。
同時檢測到Crocosphaera和Gloeothece中的 NifH 亞基，僅限于一些標明的蛋白質，目前還沒有發表關于固氮菌的全球或絕對定量蛋白質組研究。
是以，仍然不确定觀察到的晝夜轉錄組循環是否需要維持相對一緻的蛋白質組，或者實際上在每個晝夜循環期間導緻全球蛋白質組組成發生巨大變化。
蛋白質組學技術的最新進展有望闡明重要微生物的生物化學與全球生物地球化學循環之間的機制聯系，基于質譜的蛋白質組學有兩種廣泛的方法：全局鳥槍法蛋白質組學方法。
可以使用光譜計數同時半定量調查數百種蛋白質的相對豐度，以及使用選擇反應監測 (SRM) 質譜法和同位素标記的靶向方法用于對感興趣的蛋白質進行絕對定量的肽标準 。
盡管有幾項基于培養的海洋微生物研究和豐富蛋白質的實地評估, 全球和有針對性的蛋白質組學方法聯合應用于海洋生物地球化學相關問題, 例如海洋重氮營養的鐵限制, 尚未見報道。
結果與讨論
Crocosphaera watsonii中鐵金屬酶的晝夜循環和庫存使用全局和靶向液相色譜質譜 (LC-MS) 蛋白質組學技術從三個不同的培養實驗中進行了研究。
這些實驗均在 14∶10 光照∶黑暗循環中生長：在光照和黑暗光周期期間采樣的晝夜實驗（采樣 10 小時）從開燈開始和關燈 7 小時）使用一維和二維 LC-MS 方法分析全局蛋白質組。
時間過程研究（此處為 diel）每 2-3 小時采樣一次，持續 30 小時（從開燈開始 4 小時）和使用 1D LC-MS 分析全局蛋白質組和目标蛋白質的絕對數量。
以及一組生物一式三份培養物（在光照期 6.5 小時取樣，在黑暗期取樣 3 小時和 6 小時）通過質譜法分析目标蛋白質豐度。
在晝夜實驗的全局蛋白質組學一維分析中鑒定的 477 種獨特蛋白質中 [0.65% 假陽性率 (FPR)]，發現 37 種蛋白質在一天之間的豐度變化為 2 倍或更大和夜晚。
這些結果在更深的 2D 層析蛋白質組中得到證明，其中 1,108 種已鑒定蛋白質中的 160 種 (0.11% FPR) 顯示出大于 2 倍的變化。晝夜循環的時間過程清楚地顯示了蛋白質豐度的循環。
光照影響
其中 100 種蛋白質被發現高于門檻值光譜計數信号 (≥10) 并顯示振幅的晝夜變化 (最大 - 最小 ≥14)聚類分析揭示了兩大類，其中包括關鍵的光系統或固氮蛋白，它們分别在白天和夜間增加了豐度。
這些實驗表明，在單細胞固氮菌的轉錄組中觀察到的晝夜循環在全局蛋白質組中表現出大規模變化，其中晝夜實驗中超過 20% 的測量蛋白質顯示晝夜變化。
在晝夜和晝夜實驗中，參與固氮的金屬酶在Crocosphaera watsonii是豐度變化最顯着的那些，白天基本不存在，晚上出現。
基于這些全局實驗，使用同位素标記的内标通過三重四極杆 SRM 質譜法測定了 diel 實驗中九個蛋白質靶标的絕對豐度。
三種固氮酶金屬蛋白的豐度範圍從光周期期間的不可檢測水準到黑暗時期蛋白質組中最豐富的蛋白質之一。
在其豐度峰值時，鐵蛋白與钼鐵蛋白亞基（此處使用的α）的比率為 3.5∶1，這與先前觀察到的 3∶1 細胞比率和固氮酶内 2∶1 的化學計量一緻蛋白質複合物。
這些全局和有針對性的蛋白質組測量一起為固氮酶複合物中金屬酶的夜間合成以及随後的完全晝夜降解提供了證據。
觀察到黃素氧還蛋白在黑暗時期的豐度增加，類似于固氮酶金屬酶，并且與在缺鐵條件下在大多數浮遊植物中觀察到的黃素氧還素豐度增加形成對比。
這表明鐵氧還蛋白-黃素還蛋白替代光合作用中的電子傳遞在鳄魚目中沒有明顯發生，在光照期間對短期鐵剝奪實驗的全局蛋白質組進行采樣，以區分鐵效應和暗表達。
蛋白影響
在添加外源性鐵載體後 24 小時，未觀察到黃素氧還蛋白響應鐵脅迫而增加，這與黃素氧還蛋白可以作為固氮酶而不是鐵氧還蛋白的電子載體的假設一緻。
即使在鐵充足的條件下，在夜間使用黃素氧還蛋白似乎是對這種微生物細胞鐵需求整體最小化的一種适應。
在固氮酶金屬酶和黃素氧還蛋白的鏡像中，許多蛋白質在光周期期間更豐富，特别是，來自富含鐵的光系統 I 的幾種蛋白質在黑暗時期減少，在光照時期增加。
包括 PsaA、PsaB、PsaD 和 PsaF。含鐵細胞色素 b6 和 c550 是通過光譜計數檢測到的最豐富的細胞色素之一（還檢測到 f、P450 和 b559 和 c 氧化酶），
并且通過靶向質譜法測量在黑暗時期豐度大幅下降。大量細胞色素 b6 和 c550 的降解會在黑暗時期釋放出大量含鐵血紅素。在蛋白質組中鑒定出兩種能夠從血紅素中釋放鐵的血紅素加氧酶，
它們顯示出晝夜變化，并且可能在鐵循環中很重要。在蛋白質組中也鑒定出儲鐵細菌鐵蛋白，其中之一顯示出一定的晝夜周期性。考慮到鐵被認為是在不降解的情況下從鐵蛋白籠中添加和去除的，是以對于細菌鐵蛋白不一定會出現晝夜循環。
轉錄和免疫學
這些結果描繪了一個動态的Crocosphaera蛋白質組，改變其金屬酶庫存以适應固氮和光合生化活動的交替時間需求。盡管Crocosphaera獨特的夜間固氮酶活性是其在實驗室和野外研究中的決定性特征之一，
但由于轉錄和免疫學方法的技術限制，固氮酶蛋白複合物在光照期間的命運仍存在争議, 其中轉錄本不測量蛋白質豐度，免疫學方法可能無法檢測翻譯後修飾的蛋白質。
通過對每種蛋白質的多種胰蛋白酶肽進行質譜分析，本研究表明固氮酶複合物中的金屬酶幾乎完全降解，光合作用的某些含鐵成分部分降解。考慮到潛在的顯着能量成本，
我們在Crocosphaera watsonii中觀察到的蛋白質組循環的程度令人驚訝。如前所述，這種蛋白質組循環可能具有防止氧氣破壞固氮酶複合物的雙重功能，以及提供顯着減少代謝鐵需求的機制。
我們認為後者是正确的，基于A - H中定量金屬酶資料的化學計量計算以及每種金屬酶的相關鐵化學計量。通過總結與主要金屬酶相關的鐵，我們計算了整個晝夜循環中參與固氮和光合作用的鐵量。
通過在不使用時降解這些金屬酶，Crocosphaera與這些金屬酶未降解的假設情況相比，在任何給定時間，峰值夜間、峰值日和最小值的鐵金屬酶庫存分别減少了 38%、40% 和 75%。
固氮和光合作用
對生物一式三份進行靶向蛋白質分析的另一項實驗與晝夜實驗中鐵守恒的這些估計一緻，在光周期（開燈後 6.5 小時，n = 3）期間使用的鐵減少了 45 ± 19%，以及 38 ± 14 %在黑暗時期減少 38 ± 22% 的鐵（在熄燈後 3 小時和 6 小時采樣， 每個n = 3）。
如果在黑暗時期觀察到不含鐵的黃素氧還蛋白，那麼這些鐵用量的節省會更大被需要鐵的鐵氧還蛋白取代。這些金屬酶降解釋放的鐵可能有幾種命運，
包括儲存在細菌鐵蛋白或伴侶蛋白中、從細胞中損失以及在其他金屬酶中重新使用。考慮到上層海洋嚴重的鐵限制條件，似乎有一部分釋放出來的鐵存量參與了固氮和光合作用代謝過程。
這種鐵保護政策類似于 hotbunking 的海上實踐，指的是航行時搭載的水手（金屬酶需求）多于鋪位（鐵原子）的船隻，相反輪班的水手共享同一個鋪位——保持鋪位持續熱（或鐵使用中的原子）。
雖然在方法學上很難記錄代謝之間共享單個鐵原子，但我們的資料清楚地證明了通過晝夜蛋白質組循環減少鐵金屬酶庫存和同時減少代謝鐵需求。
通過減少金屬酶庫存來儲存鐵可能是鳄魚目低鐵海洋生态位的關鍵組成部分。毛黴屬 是另一種占主導地位的含氧海洋固氮菌，它不同于鳄球藻，因為它在光周期中同時固定氮和碳。
結果是Trichodesmium sp。可能不會像Crocosphaera那樣采用這種鐵保護政策。這與Trichodesmium與Crocosphaera（> 35 和 16 ± 11 μ分别為mol Fe mol C -1 )，以及對Trichodesmium中固氮所需的大部分細胞鐵 (22–50%) 的估計。
先前對Crocosphaera watsonii細胞鐵的研究觀察到在黑暗時期每個細胞的鐵濃度增加。我們計算出的每個細胞的鐵含量歸因于固氮和光合作用與測量值大緻一緻，
夜間較高的鐵含量可能是晝夜蛋白質組循環的結果，加上白天亞鐵的吸收和積累由光化學還原和光周期細胞分裂産生。
金屬酶的庫存
通過減少不使用時的固氮和光合金屬酶庫存，Crocosphaera watsonii已經進化為比在整個晝夜循環中維持這些酶少 40% 的鐵。雖然難以量化，但這種每天重新合成酶的過程肯定會消耗大量精力。
根據我們的定量測量，僅三種固氮酶金屬蛋白的晝夜循環就貢獻了總蛋白質的～2.3%，圖 3 中的所有八種靶蛋白貢獻了 5.0%（使用晝夜循環期間最大和最小表達水準之間的差異）。
許多較低豐度的蛋白質也經曆晝夜循環, 并且蛋白質貢獻了大約 40% 的細胞生物量, 這些計算提供了一些粗略的能量成本, 以增加蛋白質合成所需的能量成本,
進而減少鐵代謝需求 (此處稱為“hotbunking”)。如果Crocosphaera watsonii從一個通過晝夜維持其金屬酶的祖先進化出 hotbunking，那麼較低的鐵需求和較高的能量成本之間的權衡将如何影響Crocosphaera相對于其祖先和其他固氮菌的競争力？
一個數值全球海洋環流和生态系統模型是一個有用的工具來探索 hotbunking 對Crocosphera的影響全球海洋的栖息地和固氮率。
結語
通過此次研究我們可以發現，減少固氮菌中的金屬酶之後，鐵被腐蝕的速率變小，這個方法完全可以用來保護鐵。
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