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近期，发表在Molecular Therapy-Nucleic Acids上题为“A CAG repeat-targeting artificial miRNA lowers the mutant huntingtin level in the YAC128 model of Huntington’s disease”的文章，通过在纹状体内注射AAV5载体，将shRNA和amiRNA的CAG重复序列导入YAC128小鼠大脑中，发现shRNA和amiRNA均使突变亨廷顿蛋白水平降低，而不影响内源性亨廷顿蛋白。此外，注射amiRNA治疗小鼠使脾脏重量降至健康小鼠的特征值，并改善静态棒试验的运动性能。
1、人工靶向miRNA的CAG重复序列的设计与特性
在HD患者来源的细胞系中检测到amiR136-A2，该细胞系在突变的HTT等位基因中有较短的CAG重复区。研究人员通过使用两种抗HTT抗体，证明amiR136-A2可显著降低突变HTT蛋白水平。再以含有16、40和57个CAG重复序列的HTT外显子1为靶点，通过荧光素酶分析amiR136-A2的等位基因选择潜力，观察到amiR136-A2的重复长度依赖性沉默。
其中有40个CAG重复序列的靶序列，HTT沉默效率约为50%，而有16个CAG重复序列的正常HTT变体的表达减少约20%，这证实了amiR136-A2的等位基因偏好(图1)。
图1：不同amiRNAs的效率和等位基因选择性
2、ShA2和amiR136-A2以等位基因选择性方式降低体内突变HTT水平
将表达shA2或amiR136-A2的AAV5载体分别单侧注射到小鼠的纹状体中。注射后一个月，处死小鼠，并处理其大脑。研究人员使用H1或CAG启动子特异性引物进行RT-qPCR，发现注射小鼠中的载体DNA水平与HTT蛋白的沉默效率相关。
与SCR对照组相比，表现出最强载体转导的小鼠的HTT蛋白水平下降幅度最大，但内源性mHTT水平没显著降低。在一些动物中观察到海马和皮层的HTT沉默程度高于纹状体，这可部分解释为AAV5-GFP在周围区域的广泛不均匀分布(图2)。
图2：AAV5-GFP在YAC128小鼠脑内的分布以及CAG靶向RNAi触发器在体内的效率和等位基因选择性
3、接受shA2与amiR136-A2治疗的小鼠的长期疗效比较
成年小鼠接受双侧纹状体内注射低、高剂量携带shA2或amiR136-A2的AAV5。注射后每5周，评估小鼠体重，并进行行为测试。注射后20周，处死小鼠，取出大脑、心脏和脾脏，称重并快速冷冻以进行分析。
经过Western印迹分析发现，与SCR对照组相比，不管低剂量或高剂量的shA2和amiR136-A2治疗，这两分子都以等位基因选择性的方式沉默HTT的表达。研究人员再对HTT转录水平的分析未显示对照组和amiR136-A2治疗组动物之间的任何差异，证实了翻译抑制作用机制(图3)。
图3：纹状体内注射A2 shRNA和amiRNA小鼠20周后HTT蛋白和mRNA水平分析
另外，YAC128小鼠表现出年龄依赖性神经病理学，表现为全脑萎缩，包括纹状体丢失和HTT聚集，而amiR136-A2处理的小鼠纹状体中polyQ聚集体数量呈剂量依赖性减少(图4)。
图4：注射amiR136-A2 20周后HTT聚集物数量减少
4、注射amiR136-A2 20周后，小鼠表现耐受性良好
与其他组的小鼠相比，注射低剂量shA2的小鼠体重较轻，且体重不会随时间增加。在实验结束后，对心脏、大脑和脾脏进行称重，发现amiR136-SCR对照组和amiR136-A2治疗组动物的器官重量仅在脾脏存在显著差异，未观察到注射脑区的组织病理学变化。
研究人员选择与A2 siRNA完全互补的转录本(Golga4、Soga3、Maml1、Ccdc177、Th和Ppp1r3f)，发现高剂量amiR136-A2只能下调六个受试转录本中的一个(Golga4)，但下调在统计上并不显著(图5)。
图5：纹状体内注射amiR136-A2后缺乏明显的脱靶效应
5、ShA2和amiR136-A2可改善某些运动和认知缺陷
研究人员对小鼠进行加速rotarod试验去评估运动缺陷的改善情况和学习能力时，发现接受高剂量shA2治疗的小鼠表现优于接受对照shSCR治疗的小鼠，但在术后15周时，低剂量shA2治疗显著影响YAC128小鼠的学习能力。
此外，通过静态棒试验评估小鼠的运动能力时发现，在治疗15周后，用shA2和amiR136-A2治疗的小鼠都比WT小鼠更快穿过17 mm杆。而且与shSCR对照组相比，都表现出显著的性能差异。
6、总结
目前，降低HTT水平的治疗策略在减少HD病理方面有良好前景和临床意义。使用非选择性amiRNA和AAV5载体的最先进的基于RNAi的方法正在进行I期/IIa临床试验，这为治疗其他polyQ疾病提供额外的等位基因选择性。
总而言之，该CAG靶向策略和amiRNA可为HD治疗方法做出独创性和有价值的贡献。
编译作者：brainnews创作团队