《自然·免疫学》：首次揭开免疫检查点LAG3抑制T细胞抗癌活性的机制

T细胞是机体抗肿瘤的主力军，它们通过T细胞受体（TCR）与抗原提呈细胞上的肿瘤抗原肽-MHC复合物结合并被激活，进而杀伤肿瘤细胞。

然而强大的T细胞也有“精疲力竭”的时候，尤其是在面对慢性感染和肿瘤时，T细胞会上调表达一些免疫检查点分子，如PD-1、LAG3等[1-3]。这些免疫检查点分子会抑制T细胞的效应功能，阻碍机体的抗肿瘤免疫。

为了解除免疫检查点对T细胞的抑制作用，免疫检查点抑制剂应运而生，其中LAG3抑制剂已经被FDA批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤。但是我们至今还不清楚LAG3到底是如何发挥作用的，对LAG3作用机制的研究将会为我们开发更有效的药物提供参考。

近日，由匹兹堡大学医学院Dario AA Vignali教授和Creg Workman博士领衔的研究团队，在Nature Immunology杂志发表研究成果[4]，他们的研究表明LAG3可以与TCR结合并降低免疫突触局部pH，破坏T细胞辅助受体（CD4或CD8）与TCR下游激酶Lck的结合，进而阻碍TCR信号向下游传递，抑制T细胞的活化。

这项研究成果揭示了LAG3发挥作用的全新机制，为开发更好的LAG3抑制剂提供了依据，同时也为激活LAG3抑制自身免疫病提供了参考。

论文首页截图

已有的研究表明LAG3可以与MHCⅡ类分子结合[5]，为了探究LAG3抑制T细胞功能是否依赖与和MHCⅡ类分子的结合，Vignali教授团队在体外使用anti-CD3和anti-CD28的抗体刺激纯化的WT或者Lag3-/-小鼠的CD8+T细胞和CD4+T细胞，然后检测T细胞的增殖能力，以及CD3/CD28信号引起的钙离子流强弱。

结果他们发现，在这个不存在MHCⅡ类分子的体系中，LAG3也能有效抑制T细胞的增殖以及钙离子流。这些数据表明，LAG3可以在不与MHCⅡ类分子结合的情况下抑制T细胞的活性。

LAG3在不与MHCⅡ类分子结合的情况下抑制T细胞的活性

由于LAG3能够抑制CD3/CD28信号引起的钙离子流，Vignali教授团队想知道LAG3与TCR复合物存在怎样的位置关系。

通过全内反射荧光显微镜观察，研究团队发现LAG3与TCR复合物具有明显的共定位关系，免疫共沉淀实验证明LAG3可以组成性地结合到TCR上，并且这种结合在T细胞激活后迅速增加。

这些数据表明，无论是否存在MHCⅡ类分子，LAG3都可以与TCR-CD3复合物结合，并且在没有MHCⅡ的情况下限制TCR信号传导和T细胞增殖。

LAG3可以组成性地与TCR-CD3复合物结合

先前有研究表明，LAG3以CD4依赖的方式抑制T细胞增殖[6]，因此Vignali教授团队探究了LAG3与T细胞共受体CD4或CD8之间是否存在相互作用。结果显示，LAG3的胞内段可以与CD4、CD8的胞内段相互结合。

因为CD4和CD8可以与TCR下游激酶Lck结合，进而启动TCR下游信号转导，因此研究团队想知道LAG3与CD4、CD8的相互作用是否会影响它们与Lck的结合。通过显微观察，研究团队发现，LAG3与CD4、CD8的相互作用减少了CD4/CD8与Lck的相互作用。

LAG3能够与T细胞共受体CD4/CD8相互作用并抑制其与Lck的结合

上述的数据表明，LAG3可以与T细胞共受体CD4以及CD8相互作用，并抑制共受体与Lck的相互作用，这可能是LAG3能够在不与MHCⅡ类分子结合的情况下抑制T细胞活性的原因。那么，LAG3是如何抑制共受体与Lck的相互作用的呢？

CD4和CD8在Zn2+的帮助下通过二胱氨酸基序与Lck结合[7]，由于LAG3胞内段与Lck具有相近的酸性等电点，并且LAG3胞内段保守的EP基序中的谷氨酸残基也能与Zn2+结合，因此Vignali教授团队猜想，LAG3可能是通过置换了Zn2+来减少CD4/CD8与Lck相互作用的。

为了验证这个猜想，研究团队合成了WT以及多种突变型LAG3胞内段肽，将其与CD4-Lck复合物孵育，检测这些肽段对CD4-Lck相互作用的影响，并使用该体系探究额外加入Zn2+能否“挽救”CD4与Lck的相互作用。结果显示，LAG3的胞内段可以阻碍CD4与Lck的相互作用，并且突变分析表明其中的谷氨酸残基至关重要，而额外添加Zn2+则有效挽救了CD4与Lck的结合。使用CD8-Lck进行实验也得到了同样的结果。

LAG3依赖胞内EP基序置换Zn2+阻碍CD4/CD8与Lck的相互作用

考虑到Lck是TCR下游关键的激酶之一，对TCR信号向下游传递至关重要，因此，研究人员想知道LAG3阻碍共受体与Lck之间的相互作用，是否会影响到TCR信号的转导。为此，他们检测了TCR下游关键分子ZAP70的磷酸化水平，发现LAG3胞内段肽能够以EP基序依赖的方式降低p-ZAP70水平。

这些数据表明LAG3可以通过置换Zn2+来阻碍共受体与Lck的相互作用，进而抑制TCR信号向下游传递。

LAG3依赖胞内EP基序抑制TCR下游信号转导

总而言之，这项研究成果首次揭示了LAG3能够以MHCⅡ类分子非依赖的方式发挥免疫抑制作用的机制。不过，这项成果没有排除LAG3与MHCⅡ类分子结合发挥抑制作用的可能性，尤其是当抗原提呈细胞上MHCⅡ类分子数量有限的情况下，LAG3可以与CD4以及TCR竞争性结合MHCⅡ，从而减少TCR活化信号。

目前临床上用于治疗癌症的LAG3抑制剂主要通过阻断LAG3-MHC II相互作用。这项研究为后续开发新的针对LAG3和LAG3-TCR的药物提供了见解；同时也可能为LAG3激动剂的开发提供参考，以治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。

参考文献：

1. Andrews LP, Marciscano AE, Drake CG, Vignali DA. LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunol Rev. 2017;276(1):80-96. doi:10.1111/imr.12519

2. Maruhashi T, Sugiura D, Okazaki IM, Okazaki T. LAG-3: from molecular functions to clinical applications. J Immunother Cancer. 2020;8(2):e001014. doi:10.1136/jitc-2020-001014

3. Ruffo E, Wu RC, Bruno TC, Workman CJ, Vignali DAA. Lymphocyte-activation gene 3 (LAG3): The next immune checkpoint receptor. Semin Immunol. 2019;42:101305. doi:10.1016/j.smim.2019.101305

5. Huard B, Mastrangeli R, Prigent P, et al. Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(11):5744-5749. doi:10.1073/pnas.94.11.5744

6. Workman CJ, Dugger KJ, Vignali DA. Cutting edge: molecular analysis of the negative regulatory function of lymphocyte activation gene-3. J Immunol. 2002;169(10):5392-5395. doi:10.4049/jimmunol.169.10.5392

7. Kim PW, Sun ZY, Blacklow SC, Wagner G, Eck MJ. A zinc clasp structure tethers Lck to T cell coreceptors CD4 and CD8. Science. 2003;301(5640):1725-1728. doi:10.1126/science.1085643

责任编辑丨BioTalker