今天推送的文章是发表在ACS Food Science & Technology上的“Secretion of Bacillus amyloliquefaciens Levansucrase and Its Mutants from L. lactis NZ9000 and Their Applications in the Synthesis of Levan”。
Levan（左聚糖）是指一种由呋喃果糖残基组成的多糖，通常是由果聚糖蔗糖酶催化产生的。它是一种有价值的食品原料，由于其良好的物理化学性质也具有医疗应用。果聚糖蔗糖酶是一种产左聚糖的微生物酶，属于糖苷水解酶家族68(GH68)。作者团队克隆了解淀粉芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(Ba-SacB)，并成功地在食品级宿主枯草杆菌中表达了它。枯草杆菌重组菌株的构建往往涉及穿梭质粒，使得分子构建过程变得复杂。因此，寻找一种更安全、更易操作的宿主菌株来生产果聚糖蔗糖酶是食品工业所需要的。乳酸乳球菌是一种革兰氏阳性的食品级细菌，广泛应用于食品等行业，通常被认为是一种安全的益生菌。
在本研究中，作者在乳酸乳球菌中克隆了两个启动子控制下的SacB基因。一种是Pp5 启动子，另一种是诱导型PPnisA启动子。作者还构建了三个突变体(E313V、E313F和E313L)，并将E313F固定在Fe3O4纳米粒子上，制备了固定化E313F。对这些突变体的酶学性质进行了测定。研究发现，对该酶进行定点突变和固定化可以有效地提高该酶的性质。以E313F@NPs为原料合成了Levan，并对合成条件进行了优化。
如图1所示，作者在乳酸乳杆菌NZ9000中进行了Ba-SacB的表达与纯化，当nisin浓度为2 ng/mL时，Ba-SacB的产量最高，诱导型表达系统明显优于组成型表达系统，因此选择诱导型菌株来构建突变株。如图2所示，作者绘制了含有不同载体的乳酸乳杆菌NZ9000的生长曲线。所有的菌株都有相似的生长曲线，这表明与携带空载体的菌株相比，Ba-SacB的表达对产生菌的生长几乎没有影响。
图1
图2
Ba-SacB及其突变体E313F、E313V和E313L的酶学性质。图3给出了不同温度下Ba-SacB、E313V、E313F和E313L的相对酶活性。在40℃时酶活最高，为230.93 U/mg，分别是30/35/45/50/55/60℃时的1.21、1.09、1.36、1.50、1.64和1.82倍。与野生型相比，突变株E313V在40−45℃时酶活几乎没有明显差异，但在45℃以上时，酶活迅速下降，且低于相同温度下的酶活性。突变株E313F的最大酶活在55℃时达到最大值，比Ba-SacB的最适温度高15℃，表明突变株E313F的耐热性得到了提高。在较高温度下，突变株E313L的酶活力显著高于Ba-SacB菌株，在40℃时达到最大值，是Ba-SacB菌株在40℃时酶活力的1.13倍。
通过测量在40℃、45℃和50℃下储存不同时间(0/2/4/8/16/24 h)的样品的酶活性来监测热稳定性。结果如图3B/C/D所示。在40℃下，所有酶的相对活性在0−4h内迅速下降(图3B)。与其他三种酶相比，E313F的相对酶活性在24 h后略低于E313L，而在其他时间段则高于其他三种酶。然后，作者研究了在45℃和50℃下储存的Ba-SacB及其三个突变体的酶活性(图3C/D)。同样，所有酶活性基本都有一定程度的下降，但E313F仍保持着最高的酶活性。保存24 h后，E313F仍保持原酶活力的61.77%(40℃)、59.73%(45℃)和58.99%(50℃)。
表2
图3E显示了不同pH值对酶活性的影响。其最大酶活为242.09 U/mg，分别是3/4/5/7/8/9时的2.12、1.63、1.38、1.18、1.62和2.62倍。图3F显示了酶在不同pH(3/4/5/6/7/8/9)下放置8h后的相对酶活性，发现所有酶的相对酶活性变化趋势相似。表2总结了不同的金属离子对Ba-SacB、E313L、E313V和E313F酶活性的影响。同一列中不同上标字母的平均值在p<0.05处有显著差异。K+、Na+对酶活力无明显影响，而Co2+、Mg2+、Sn2+、Fe3+、Ca2+对酶活力有明显的促进作用。在这些金属离子中，Ca2+对酶活力的影响最大，比不加金属离子的酶活力高2−~3倍。这可能与含有钙离子作用部位的酶有直接关系。
图3
E313F在磁性多孔Fe3O4 纳米颗粒上的固定化。如图4A4A所示，Fe3O4已成功生成，其磁性可用于后期固定化酶的回收。用扫描电子显微镜研究了Fe3O4 纳米粒子的结构。图4B4B显示所制备的Fe3O4@NPs为规则球形，表面粗糙，分散性好。粗糙的表面证明了Fe3O4@NPs具有多孔结构，这也有利于提高粒子的比表面积并与其他分子结合，即E313F。研究了E313F/Fe3O4摩尔比、pH值、固定化时间对固定化E313F制备过程的影响。如图5A所示，当E313F/Fe3O4为20 mg/g时，IY达到最大值93.10%，AR也达到最大值91.78%，均高于其他浓度比。此外，达到的最高AR为93.57%。图5B表明，当pH从4上升到10时，固定化效率降低，这可能是由于Fe3O4@NPs在酸性条件下表面质子化所致。同时，在pH为6时，AR达到最大值89.33%。因此，虽然酸性环境有利于酶的固定化，但考虑到酶的活性，选择了pH为6的缓冲液进行固定化。作者发现AR在2h时达到最大值，但在2h后下降，而IY则在0−2 h时迅速增大，然后减慢(图5C)。据此确定最佳固定化时间为2h。
图4
图5
测定了固定化E313F、游离型Ba-SacB和游离型E313F在不同温度和pH值下的活性。如图6A所示，固定化E313F的最适温度为55℃，比游离的Ba-SacB高15°，与游离的E313F相同。图6B/C/D显示，固定化E313F、游离态E313F和游离态Ba-SacB在40℃、45℃和50°C保存24 h时，酶活性下降，其中以Ba-SacB的影响更大。如图6E所示，固定化E313F的最适pH为7，游离态Ba-SacB和游离态E313F的最适pH为6。储存8小时后的pH稳定性结果如图6F所示。游离的Ba-SacB和游离的E313F在pH为6时保持最高的相对活性，固定化的E313F在pH为7时保持最高的相对活性，这可能与固定化材料有关。在pH 7−9时，固定化E313F的酶活力明显高于游离的Ba-SacB和游离的E313F，说明固定化的E313F保持了酶的活力。Fe3O4@NPs具有被磁体吸附的特性。因此，固定化的E313F可以用磁铁回收。如图6G所示，固定化E313F在重复使用10次后仍具有61.93%的初始活性。
图6
E313F@NPs合成Levan的条件优化。据报道，Ba-SacB对蔗糖具有高度的特异性。如图7a所示，在E313F@NPs存在的情况下，使用200g/L的蔗糖可以获得最大的Levan合成。已有文献报道果聚糖蔗糖酶具有钙离子亲和位点，因此作者探索了钙离子浓度对E313F@NPs合成左聚糖的影响。发现在5 mM的钙离子下，Levan的合成量最大(图7b)。与其他报道相比，钙离子浓度降低了15mM。如图7C所示，E313F@NPs合成Levan的最适温度为55℃，与上面确定的最适温度相同。固定化酶不能提高Levan的最适合成温度，这与以往的报道不一致。如图7d所示，E313F@NPs合成Levan的最适pH为7，而游离E313F合成Levan的最适pH为6。结合pH稳定性实验，确定E313F@NPs合成Levan的最适pH为7。图7E表明，当反应时间为14h时，Levan的产量最大。14h后下降。这可能是由于合成的Levan的水解所致。综上所述，最佳合成条件为：5μg/mL E313F@NPS，200g/L蔗糖，5 mM Ca2+，pH=7，反应体系的溶液在55℃下培养14 h，在此条件下进行合成，并用高效液相色谱分析反应产物的组成。结果表明，Ba-SacB反应体系的蔗糖转化率为66.75%，以200g/L蔗糖为原料催化合成Levan的产率为41.65%。
图7
END
文章信息：https://doi.org/10.1021/acsfoodscitech.1c00455