今天推送的文章是發表在ACS Food Science & Technology上的“Secretion of Bacillus amyloliquefaciens Levansucrase and Its Mutants from L. lactis NZ9000 and Their Applications in the Synthesis of Levan”。
Levan（左聚糖）是指一種由呋喃果糖殘基組成的多糖，通常是由果聚糖蔗糖酶催化産生的。它是一種有價值的食品原料，由于其良好的實體化學性質也具有醫療應用。果聚糖蔗糖酶是一種産左聚糖的微生物酶，屬于糖苷水解酶家族68(GH68)。作者團隊克隆了解澱粉芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(Ba-SacB)，并成功地在食品級宿主枯草杆菌中表達了它。枯草杆菌重組菌株的建構往往涉及穿梭質粒，使得分子建構過程變得複雜。是以，尋找一種更安全、更易操作的宿主菌株來生産果聚糖蔗糖酶是食品工業所需要的。乳酸乳球菌是一種革蘭氏陽性的食品級細菌，廣泛應用于食品等行業，通常被認為是一種安全的益生菌。
在本研究中，作者在乳酸乳球菌中克隆了兩個啟動子控制下的SacB基因。一種是Pp5 啟動子，另一種是誘導型PPnisA啟動子。作者還建構了三個突變體(E313V、E313F和E313L)，并将E313F固定在Fe3O4納米粒子上，制備了固定化E313F。對這些突變體的酶學性質進行了測定。研究發現，對該酶進行定點突變和固定化可以有效地提高該酶的性質。以E313F@NPs為原料合成了Levan，并對合成條件進行了優化。
如圖1所示，作者在乳酸乳杆菌NZ9000中進行了Ba-SacB的表達與純化，當nisin濃度為2 ng/mL時，Ba-SacB的産量最高，誘導型表達系統明顯優于組成型表達系統，是以選擇誘導型菌株來建構突變株。如圖2所示，作者繪制了含有不同載體的乳酸乳杆菌NZ9000的生長曲線。所有的菌株都有相似的生長曲線，這表明與攜帶空載體的菌株相比，Ba-SacB的表達對産生菌的生長幾乎沒有影響。
圖1
圖2
Ba-SacB及其突變體E313F、E313V和E313L的酶學性質。圖3給出了不同溫度下Ba-SacB、E313V、E313F和E313L的相對酶活性。在40℃時酶活最高，為230.93 U/mg，分别是30/35/45/50/55/60℃時的1.21、1.09、1.36、1.50、1.64和1.82倍。與野生型相比，突變株E313V在40−45℃時酶活幾乎沒有明顯差異，但在45℃以上時，酶活迅速下降，且低于相同溫度下的酶活性。突變株E313F的最大酶活在55℃時達到最大值，比Ba-SacB的最适溫度高15℃，表明突變株E313F的耐熱性得到了提高。在較高溫度下，突變株E313L的酶活力顯著高于Ba-SacB菌株，在40℃時達到最大值，是Ba-SacB菌株在40℃時酶活力的1.13倍。
通過測量在40℃、45℃和50℃下儲存不同時間(0/2/4/8/16/24 h)的樣品的酶活性來監測熱穩定性。結果如圖3B/C/D所示。在40℃下，所有酶的相對活性在0−4h内迅速下降(圖3B)。與其他三種酶相比，E313F的相對酶活性在24 h後略低于E313L，而在其他時間段則高于其他三種酶。然後，作者研究了在45℃和50℃下儲存的Ba-SacB及其三個突變體的酶活性(圖3C/D)。同樣，所有酶活性基本都有一定程度的下降，但E313F仍保持着最高的酶活性。儲存24 h後，E313F仍保持原酶活力的61.77%(40℃)、59.73%(45℃)和58.99%(50℃)。
表2
圖3E顯示了不同pH值對酶活性的影響。其最大酶活為242.09 U/mg，分别是3/4/5/7/8/9時的2.12、1.63、1.38、1.18、1.62和2.62倍。圖3F顯示了酶在不同pH(3/4/5/6/7/8/9)下放置8h後的相對酶活性，發現所有酶的相對酶活性變化趨勢相似。表2總結了不同的金屬離子對Ba-SacB、E313L、E313V和E313F酶活性的影響。同一列中不同上标字母的平均值在p<0.05處有顯著差異。K+、Na+對酶活力無明顯影響，而Co2+、Mg2+、Sn2+、Fe3+、Ca2+對酶活力有明顯的促進作用。在這些金屬離子中，Ca2+對酶活力的影響最大，比不加金屬離子的酶活力高2−~3倍。這可能與含有鈣離子作用部位的酶有直接關系。
圖3
E313F在磁性多孔Fe3O4 納米顆粒上的固定化。如圖4A4A所示，Fe3O4已成功生成，其磁性可用于後期固定化酶的回收。用掃描電子顯微鏡研究了Fe3O4 納米粒子的結構。圖4B4B顯示所制備的Fe3O4@NPs為規則球形，表面粗糙，分散性好。粗糙的表面證明了Fe3O4@NPs具有多孔結構，這也有利于提高粒子的比表面積并與其他分子結合，即E313F。研究了E313F/Fe3O4摩爾比、pH值、固定化時間對固定化E313F制備過程的影響。如圖5A所示，當E313F/Fe3O4為20 mg/g時，IY達到最大值93.10%，AR也達到最大值91.78%，均高于其他濃度比。此外，達到的最高AR為93.57%。圖5B表明，當pH從4上升到10時，固定化效率降低，這可能是由于Fe3O4@NPs在酸性條件下表面質子化所緻。同時，在pH為6時，AR達到最大值89.33%。是以，雖然酸性環境有利于酶的固定化，但考慮到酶的活性，選擇了pH為6的緩沖液進行固定化。作者發現AR在2h時達到最大值，但在2h後下降，而IY則在0−2 h時迅速增大，然後減慢(圖5C)。據此确定最佳固定化時間為2h。
圖4
圖5
測定了固定化E313F、遊離型Ba-SacB和遊離型E313F在不同溫度和pH值下的活性。如圖6A所示，固定化E313F的最适溫度為55℃，比遊離的Ba-SacB高15°，與遊離的E313F相同。圖6B/C/D顯示，固定化E313F、遊離态E313F和遊離态Ba-SacB在40℃、45℃和50°C儲存24 h時，酶活性下降，其中以Ba-SacB的影響更大。如圖6E所示，固定化E313F的最适pH為7，遊離态Ba-SacB和遊離态E313F的最适pH為6。儲存8小時後的pH穩定性結果如圖6F所示。遊離的Ba-SacB和遊離的E313F在pH為6時保持最高的相對活性，固定化的E313F在pH為7時保持最高的相對活性，這可能與固定化材料有關。在pH 7−9時，固定化E313F的酶活力明顯高于遊離的Ba-SacB和遊離的E313F，說明固定化的E313F保持了酶的活力。Fe3O4@NPs具有被磁體吸附的特性。是以，固定化的E313F可以用磁鐵回收。如圖6G所示，固定化E313F在重複使用10次後仍具有61.93%的初始活性。
圖6
E313F@NPs合成Levan的條件優化。據報道，Ba-SacB對蔗糖具有高度的特異性。如圖7a所示，在E313F@NPs存在的情況下，使用200g/L的蔗糖可以獲得最大的Levan合成。已有文獻報道果聚糖蔗糖酶具有鈣離子親和位點，是以作者探索了鈣離子濃度對E313F@NPs合成左聚糖的影響。發現在5 mM的鈣離子下，Levan的合成量最大(圖7b)。與其他報道相比，鈣離子濃度降低了15mM。如圖7C所示，E313F@NPs合成Levan的最适溫度為55℃，與上面确定的最适溫度相同。固定化酶不能提高Levan的最适合成溫度，這與以往的報道不一緻。如圖7d所示，E313F@NPs合成Levan的最适pH為7，而遊離E313F合成Levan的最适pH為6。結合pH穩定性實驗，确定E313F@NPs合成Levan的最适pH為7。圖7E表明，當反應時間為14h時，Levan的産量最大。14h後下降。這可能是由于合成的Levan的水解所緻。綜上所述，最佳合成條件為：5μg/mL E313F@NPS，200g/L蔗糖，5 mM Ca2+，pH=7，反應體系的溶液在55℃下培養14 h，在此條件下進行合成，并用高效液相色譜分析反應産物的組成。結果表明，Ba-SacB反應體系的蔗糖轉化率為66.75%，以200g/L蔗糖為原料催化合成Levan的産率為41.65%。
圖7
END
文章資訊：https://doi.org/10.1021/acsfoodscitech.1c00455