大家好，今天推送的文章来自Biomolecules上的
“Endo-β-1,3-glucanase (GH16 Family) from
Trichoder
ma harzianumParticipates in Cell Wall Biogenesis but Is Not Essential for Antagonism Against Plant Pathogens”作者为巴西联邦大学生物科学研究所的Marcela Suriani Ribeiro等人。
木霉属以其产生溶解酶的能力而闻名，如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶，这些酶在植物病原菌的细胞壁降解中起着重要作用。β-葡聚糖酶在木霉物种发育和分化过程中的形态发生-形态学过程中起着至关重要的作用，其中β-葡聚糖是其细胞壁的主要成分。尽管葡聚糖酶在木霉真菌寄生过程中具有重要意义，但对葡聚糖酶的功能分析研究较少。在该研究中，作者采用功能基因组学方法研究了gluc31基因的功能作用，该基因编码哈氏木霉ALL16家族的内切-β-1,3-葡聚糖酶。作者发现，gluc31基因的缺失并不影响突变体ALL42的体内真菌寄生能力；然而，gluc31明显影响细胞壁组织。聚合物测量和荧光显微镜分析表明，gluc31基因的缺失通过增加突变菌丝细胞壁上几丁质和葡聚糖聚合物的产生而诱导了代偿反应。与亲本菌株相比，突变株对杀菌剂苯甲基的抗性更强。此外，qRT-PCR分析显示，水稻中gluc31的缺失导致GH16家族的其他糖基水解酶表达差异，因为葡聚糖酶之间的功能冗余。
Gluc31参与了哈氏杆菌的细胞壁重塑
通过测定葡聚糖和几丁质含量，评价Gluc31对哈齐藻细胞壁的影响。对突变体(∆glu31)和野生型(ALL42)菌株的葡聚糖和几丁质含量进行比较，发现突变株(∆glu31)具有一定的含量较高的N-乙酰-葡萄糖胺和β-1、3-葡聚糖含量（图2F、H）。荧光显微镜分析表明，Gluc31参与了的细胞壁动力学。浸染钙氟的菌丝在顶端菌丝中有大量的几丁质积累（图2D）。此外，Gluc31的缺失降低了菌丝宽度(图3A、C)，增加了细胞壁厚度(图3B、D)。研究结果表明，Gluc31作为一种代偿效应参与了细胞壁重构，促进几丁质和葡聚糖的积累，作为对Gluc31基因缺失的响应。
细胞活力测定
由于几丁质和葡聚糖含量受到gluc31基因缺失的影响，作者检测了亲本ALL42和∆gluc31菌株的抗真菌抗性。PDA平板实验显示，与ALL42亲本菌株相比，∆gluc31突变株在0.5µg/mL苯甲基存在下具有更好的内在生长能力(图4A)。在生长6天的过程中评估了这一效应，结果显示，从生长第4天开始，与ALL42亲本株相比，突变株对苯甲基具有明显的抗性(图4B)。此外，实验研究了苯甲胺对亲本ALL42和∆gluc31株活力的影响在苯甲基液体培养基中，∆gluc31菌株比亲本菌株ALL42更具抗性(图4C)，与宏观实验中看到的类似(图4A，B)。在0.5µg/mL苯甲基时，∆gluc31突变株的生长速率开始下降，但仍高于亲本菌株ALL42。此外，与∆gluc31菌株相比，亲本菌株在1.5µg/mL的苯甲基中生长速度也很低(图4C)。总之，结果显示，∆gluc31突变株对杀菌剂苯甲基处理的抗性更强，可能是由于突变株细胞壁中几丁质和葡聚糖的高积累（图2）。
由gluc31基因编码的β-葡聚糖酶并不需要它的潜在拮抗作用
通过基因表达分析，验证了gluc31基因在拮抗过程中的活性(图5A，B)。gluc31基因在哈氏菌与植物病原体的对抗中存在差异表达。在接触条件下，哈齐菌与植物病原菌和菌核菌的拮抗过程中，gluc31基因表达上调(图5C)。另一方面，在同样的条件下，哈孢霉与尖孢霉接触过程中Gluc31不上调。此外，在接触后条件下，哈齐兰和茄兰拮抗时gluc31的表达保持不变，而在相同条件下，菌核兰接触时gluc31的表达下调。此外，与接触条件下相比，在与尖孢霉的对抗过程中，gluc31水平下调(图5D)。使用Bell等人描述的量表评估，野生型(ALL42)和突变型(∆glu31)菌株与植物病原体之间的拮抗效率没有显著差异。结合统计分析，以上结果表明，Gluc31并不需要对抗植物病原体。
验证Gluc31参与真菌寄生期间的代偿反应，作者评估了葡聚糖酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和苔衣酶，以及几丁质合酶和葡聚糖合酶的基因表达培养ALL42和∆gluc31暴露后茄兰细胞壁（图6）。孵育48h后，没有观察到几丁质酶活性的差异，但观察到∆Gluc31株的NAGase活性显著增加，以及几丁质合酶（~40倍）相对于野生型ALL42的表达上调，从而表明，Gluc31的缺失并不影响真菌寄生，但影响细胞壁重构(图2A-C）与预期的一样，∆gluc31菌株的总β-1,3-葡聚糖酶活性低于ALL42菌株(图6D)。此外，苔藓酶的活性（一种酶催化水解（1->4）-β-d葡萄糖苷键β-d-葡聚糖包含（1->3）键和（1->4）键）减少和葡聚糖合成酶水平上调（~40倍）∆gluc31株相比亲本ALL42株(图6f)。研究结果证实了即使在真菌寄生过程中，Gluc31的缺失也会对细胞壁重构的代偿性调控。
对∆Gluc31株GH16家族基因表达的影响
为了分析gluc31基因缺失在真菌寄生过程中的影响，作者在培养皿中对植物病原菌进行了直接对抗试验。结果表明，在这14个基因中，有7个菌株接触时表达上调。相比之下，∆gluc31株的GH16基因在对抗过程中表达下调，但84167基因相对于WT株表达上调，在WT菌株中，基因15000、503986和513340在接触条件下的表达量最高（分别为14倍、6倍和15倍）。然而，这些基因在∆gluc31突变株中的表达水平没有改变，说明它们在茄属植物拮抗过程中具有重要作用。有趣的是，大多数诱导的GH16基因在WT中按同源性分组（图8），从而表明该亚群可能在真菌寄生虫的相互作用中发挥作用。作者的研究结果表明，gluc31的缺失导致了葡萄糖分解系统的抑制。
基于对gluc31基因的发现，以及之前对真菌β-1,3-葡聚糖酶的研究，作者提出了一种基于同源重组敲除技术的功能基因研究。虽然gluc31在对各种植物病原体的拮抗过程中存在，但并没有发现在这一过程中发挥关键作用。此外，观察到的突变株的特征被认为是真菌细胞壁相关基因缺失的共同特征，从而提示其在细胞壁动力学中的假定功能，体外Gluc31功能分析结果证实了这一点。本研究对β-1、3-葡聚糖酶的活性提供了不同的观点，这些酶在木霉真菌寄生中的作用已被广泛认识。