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“Endo-β-1,3-glucanase (GH16 Family) from
Trichoder
ma harzianumParticipates in Cell Wall Biogenesis but Is Not Essential for Antagonism Against Plant Pathogens”作者為巴西聯邦大學生物科學研究所的Marcela Suriani Ribeiro等人。
木黴屬以其産生溶解酶的能力而聞名，如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、幾丁質酶和蛋白酶，這些酶在植物病原菌的細胞壁降解中起着重要作用。β-葡聚糖酶在木黴物種發育和分化過程中的形态發生-形态學過程中起着至關重要的作用，其中β-葡聚糖是其細胞壁的主要成分。盡管葡聚糖酶在木黴真菌寄生過程中具有重要意義，但對葡聚糖酶的功能分析研究較少。在該研究中，作者采用功能基因組學方法研究了gluc31基因的功能作用，該基因編碼哈氏木黴ALL16家族的内切-β-1,3-葡聚糖酶。作者發現，gluc31基因的缺失并不影響突變體ALL42的體内真菌寄生能力；然而，gluc31明顯影響細胞壁組織。聚合物測量和熒光顯微鏡分析表明，gluc31基因的缺失通過增加突變菌絲細胞壁上幾丁質和葡聚糖聚合物的産生而誘導了代償反應。與親本菌株相比，突變株對殺菌劑苯甲基的抗性更強。此外，qRT-PCR分析顯示，水稻中gluc31的缺失導緻GH16家族的其他糖基水解酶表達差異，因為葡聚糖酶之間的功能備援。
Gluc31參與了哈氏杆菌的細胞壁重塑
通過測定葡聚糖和幾丁質含量，評價Gluc31對哈齊藻細胞壁的影響。對突變體(∆glu31)和野生型(ALL42)菌株的葡聚糖和幾丁質含量進行比較，發現突變株(∆glu31)具有一定的含量較高的N-乙酰-葡萄糖胺和β-1、3-葡聚糖含量（圖2F、H）。熒光顯微鏡分析表明，Gluc31參與了的細胞壁動力學。浸染鈣氟的菌絲在頂端菌絲中有大量的幾丁質積累（圖2D）。此外，Gluc31的缺失降低了菌絲寬度(圖3A、C)，增加了細胞壁厚度(圖3B、D)。研究結果表明，Gluc31作為一種代償效應參與了細胞壁重構，促進幾丁質和葡聚糖的積累，作為對Gluc31基因缺失的響應。
細胞活力測定
由于幾丁質和葡聚糖含量受到gluc31基因缺失的影響，作者檢測了親本ALL42和∆gluc31菌株的抗真菌抗性。PDA平闆實驗顯示，與ALL42親本菌株相比，∆gluc31突變株在0.5µg/mL苯甲基存在下具有更好的内在生長能力(圖4A)。在生長6天的過程中評估了這一效應，結果顯示，從生長第4天開始，與ALL42親本株相比，突變株對苯甲基具有明顯的抗性(圖4B)。此外，實驗研究了苯甲胺對親本ALL42和∆gluc31株活力的影響在苯甲基液體培養基中，∆gluc31菌株比親本菌株ALL42更具抗性(圖4C)，與宏觀實驗中看到的類似(圖4A，B)。在0.5µg/mL苯甲基時，∆gluc31突變株的生長速率開始下降，但仍高于親本菌株ALL42。此外，與∆gluc31菌株相比，親本菌株在1.5µg/mL的苯甲基中生長速度也很低(圖4C)。總之，結果顯示，∆gluc31突變株對殺菌劑苯甲基處理的抗性更強，可能是由于突變株細胞壁中幾丁質和葡聚糖的高積累（圖2）。
由gluc31基因編碼的β-葡聚糖酶并不需要它的潛在拮抗作用
通過基因表達分析，驗證了gluc31基因在拮抗過程中的活性(圖5A，B)。gluc31基因在哈氏菌與植物病原體的對抗中存在差異表達。在接觸條件下，哈齊菌與植物病原菌和菌核菌的拮抗過程中，gluc31基因表達上調(圖5C)。另一方面，在同樣的條件下，哈孢黴與尖孢黴接觸過程中Gluc31不上調。此外，在接觸後條件下，哈齊蘭和茄蘭拮抗時gluc31的表達保持不變，而在相同條件下，菌核蘭接觸時gluc31的表達下調。此外，與接觸條件下相比，在與尖孢黴的對抗過程中，gluc31水準下調(圖5D)。使用Bell等人描述的量表評估，野生型(ALL42)和突變型(∆glu31)菌株與植物病原體之間的拮抗效率沒有顯著差異。結合統計分析，以上結果表明，Gluc31并不需要對抗植物病原體。
驗證Gluc31參與真菌寄生期間的代償反應，作者評估了葡聚糖酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和苔衣酶，以及幾丁質合酶和葡聚糖合酶的基因表達培養ALL42和∆gluc31暴露後茄蘭細胞壁（圖6）。孵育48h後，沒有觀察到幾丁質酶活性的差異，但觀察到∆Gluc31株的NAGase活性顯著增加，以及幾丁質合酶（~40倍）相對于野生型ALL42的表達上調，進而表明，Gluc31的缺失并不影響真菌寄生，但影響細胞壁重構(圖2A-C）與預期的一樣，∆gluc31菌株的總β-1,3-葡聚糖酶活性低于ALL42菌株(圖6D)。此外，苔藓酶的活性（一種酶催化水解（1->4）-β-d葡萄糖苷鍵β-d-葡聚糖包含（1->3）鍵和（1->4）鍵）減少和葡聚糖合成酶水準上調（~40倍）∆gluc31株相比親本ALL42株(圖6f)。研究結果證明了即使在真菌寄生過程中，Gluc31的缺失也會對細胞壁重構的代償性調控。
對∆Gluc31株GH16家族基因表達的影響
為了分析gluc31基因缺失在真菌寄生過程中的影響，作者在培養皿中對植物病原菌進行了直接對抗試驗。結果表明，在這14個基因中，有7個菌株接觸時表達上調。相比之下，∆gluc31株的GH16基因在對抗過程中表達下調，但84167基因相對于WT株表達上調，在WT菌株中，基因15000、503986和513340在接觸條件下的表達量最高（分别為14倍、6倍和15倍）。然而，這些基因在∆gluc31突變株中的表達水準沒有改變，說明它們在茄屬植物拮抗過程中具有重要作用。有趣的是，大多數誘導的GH16基因在WT中按同源性分組（圖8），進而表明該亞群可能在真菌寄生蟲的互相作用中發揮作用。作者的研究結果表明，gluc31的缺失導緻了葡萄糖分解系統的抑制。
基于對gluc31基因的發現，以及之前對真菌β-1,3-葡聚糖酶的研究，作者提出了一種基于同源重組敲除技術的功能基因研究。雖然gluc31在對各種植物病原體的拮抗過程中存在，但并沒有發現在這一過程中發揮關鍵作用。此外，觀察到的突變株的特征被認為是真菌細胞壁相關基因缺失的共同特征，進而提示其在細胞壁動力學中的假定功能，體外Gluc31功能分析結果證明了這一點。本研究對β-1、3-葡聚糖酶的活性提供了不同的觀點，這些酶在木黴真菌寄生中的作用已被廣泛認識。