卢沟桥事变后佟麟阁出任29军副军长兼军事训练团团长，率29军卫队旅、骑兵第九师一部、军事训练团和平津大学生军训班等约2万人驻守南苑。当时将军意识到中日战争不可避免，就命部下早做准备，并在动员大会上说：“日寇进犯，我军首当其冲。战死者光荣，偷生者耻辱；荣辱系于一人者轻，而系于国家民族者重。国家多难，军人应当马革裹尸，以死报国。”
随后，佟将军以军部名义向全军官兵发布命令：凡有日军进犯，坚决抵抗，誓与卢沟桥共存亡，不得后退一步。1937年7月28日凌晨4点，日军出动重兵在装甲车和飞机的配合下向南苑发起猛攻，佟麟阁率部奋起抵抗。由于汉奸的出卖，日军事先获知了国军的布防图，因此佟部很快就陷入了被动。战至下午2点左右，国军损失大半，佟麟阁也在战斗中负伤。
副官高弘锡要把他送回北平城内医治，被佟麟阁拒绝了。他大声说道：“那么多学生还在这儿呢，我走了他们怎么办！个人安危事小，抗敌事大”不久后，佟麟阁接到了撤退命令，途径大红门一带时和日军遭遇，不幸战死，年仅45岁。当时只知道将军牺牲在了大红门一带，但具体地点却不清楚。直到68年后，一位名叫乔德林的老人在做客央视的一档访谈节目时才披露了当年佟麟阁将军牺牲的地点和细节。
乔德林当时住在丰台区南苑时村，当年只有13岁。据他回忆，日军早在村子里设下了埋伏，其中有两挺机枪就架在他家的屋顶上。因此当佟麟阁将军率领部分退下来的学生兵途径时村的时候，埋伏在这里的日寇突然开火，日军的机枪首先击中了佟将军的枣红马，佟麟阁步行带着战士们往旁边的庄稼地里跑，希望借助青纱帐的掩护冲出重围。
但是日军的机枪打得很凶，弹壳不停地顺着房脊往下滚，庄稼很快都被打断了。老人回忆这一幕时用了一个很形象的形容词，说把庄稼地打得像“剃头”一样。失去了青纱帐掩护的佟麟阁将军和战士们完全暴露在了日军的火力下，佟将军头部中弹，当场牺牲。副官高弘锡冒死把将军的遗体背到了乔德林家的山药架旁。
乔德林说当时大家并不知道那位将军就是佟麟阁。他只记得将军脖子上戴着一条明晃晃的项链似的东西，村里有个姓黎的地痞，人称“麻头”，他以为这是个金项链，就跑到山药架旁伸手把这个东西从将军的怀里拉了出来，结果看到是一块怀表。“麻头”的这个行为遭到了高弘锡的强力阻止。就是这块怀表，确认了佟将军的身份。
为安全起见，高弘锡把佟麟阁身上值钱的东西--一架照相机、金链子和怀表藏在自己怀里，跑到北平城里找到当时代理宋哲元管理军务的张自忠和冯安，说佟军长牺牲了，你们赶紧想办法，无论如何得把遗体找回来。张自忠派了一个日文翻译，带着红十字会的汽车，出城到时村把佟将军的遗体给拉了回来。当高弘锡把佟将军的遗物交给他的夫人时，佟夫人承受不住这巨大的打击，当场就晕倒了。
为了避免将军的遗体背日本人找到，佟家人把灵柩藏在了雍和宫附近的柏林寺，后来为了更好地保存忠骨，曾追随了佟麟阁十年之久的王慎之先生征得佟府的同意，在柏林寺院内租借了一块地皮，将棺椁就地掩埋，未起坟冢，而是在上面修砌了一个花池子作为掩护，就这样，佟麟阁的棺椁在柏林寺，一停就是八年。抗战胜利后，国民政府为佟麟阁将军举办了盛大的国葬，上万百姓自发前来送行，场面十分感人。