今天推送的文章發表在carbohydrate polymers上的“engineering of a chitosanase fused to a carbohydrate-binding module for continuous production of desirable chitooligosaccharides”，通訊作者為江南大學生物工程學院的餘曉斌教授。
殼寡糖(chos)是一種具有抗菌活性的生物相容性陽離子多糖，因為它能粘附在細菌細胞壁上，抑制細菌的新陳代謝。chos是殼聚糖的水解産物，具有粘度低、溶解度高、吸濕性好、吸附能力強、生物相容性好等特點，在化妝品、制藥、農業和食品工業中有廣泛的應用。目前，chos的生産方法有化學、實體和酶法三種。其中，酶催化降解殼聚糖或甲殼素具有反應條件溫和、環境可持續、選擇性或特異性高等優點，具有廣闊的應用前景。
已經開發的多種酶固定化技術（包埋、交聯和載體結合），實作了産品、底物和酶的高效生産和分離。然而，在大多數情況下，固定化之前需要對酶進行純化，還需要将産物從底物和殘留酶中進行繁瑣的下遊分離。此外，酶的可重用性和穩定性仍然是酶固定化在實際生産中應用的主要瓶頸。
最近，将酶與碳水化合物結合子產品(cbm)融合的政策已被證明在一步純化和固定化中是可行的。cbm是碳水化合物酶中廣泛存在的一個小結構域，可以特異性地識别和結合碳水化合物，特别是不溶性多糖。用于固定化的載體一般是天然或食品安全的多糖，如纖維素、甲殼素和微晶纖維素。這一政策已經被發現可以改善融合酶的性質，包括它們的穩定性、活性、選擇性和特異性。
在以前的研究中，cbm融合酶的表達主要是在大腸杆菌中進行的，因為大腸杆菌總是産生胞内酶，是以需要破壞細胞。畢赤酵母作為一種高效的表達系統，隻分泌少量的自身蛋白，是以在工業應用中可以大大降低酶的純化成本。然而，畢赤酵母中的糖基化在某些情況下會降低重組cbm的底物親和力。此外，大多數cbm的固定化載體是纖維素，其結構在與cbm結合後也會受到影響。是以，尋找一種與酵母表達系統相容性好的cbm是實作殼聚糖酶一步純化和固定化的主要挑戰。
bhcbm56是bacillus haloduransβ-(1，3)-葡聚糖酶的cbm，在固定化中是一種很有前途的酶融合選擇。農杆菌水不溶性線性β-(1，3)-葡聚糖是一種安全、廉價的bhcbm56固定化載體。此外，我們還發現煙曲黴cj22-326産生的殼聚糖酶csn75能有效地制備聚合度較高的chos。是以，可以利用bhcbm56作為cbm，在c端融合csn75，在畢赤酵母中表達重組酶，最終實作csn75的一步純化或固定化。
在本研究中，我們以bhcbm56為cbm，csn75為模型酶，将殼聚糖酶融合到碳水化合物結合子產品中，以連續生産所需的chos。在畢赤酵母高效胞外表達和高密度發酵的基礎上，建立了殼聚糖酶固定化熱凝膠多糖填充床反應器(cicpr)，并進行了連續生産chos的性能試驗。并對不同的反應條件(如殼聚糖酶量、流速、底物濃度)進行了優化。在此過程中，還對cicpr的穩定性和可重用性進行了評估。
csn75、csn75-cbm和csn75-2cbm的表達與特性
重組酶csn75-cbm和csn75-2cbm在p. pastoris gs115中成功表達。sds-page分析證明了csn75、csn75-cbm和csn75-2cbm酶在胞外的表達(fig. 1a)。預測了三種酶的分子量分别為25.5 kda、35.2 kda和47.0 kda。此外，三種發酵上清液中蛋白質含量無顯著差異，說明三種酶的胞外表達量是相近的 (fig. 1b)。但是重組酶csn75-cbm和csn75-2cbm的活性分别下降到天然csn75的75.7%和25.4%。是以，為了保持較高的酶活力并實作酶的固定化，作者選擇了csn75-cbm進行進一步的研究。
csn75和csn75-cbm的活性中心分析
根據氨基酸序列預測了天然csn75(fig. 2a)和重組酶csn75-cbm(fig. 2b)的三維結構。殼聚糖水解的可能催化位點(d143和e152)用粉紅色表示，cbm中可能的curdlan結合位點(y266、d268和h270)用紅色突出顯示(fig. 2b)。重組酶csn75-cbm既具有殼聚糖水解的催化活性(由csn75提供)，又具有與熱凝膠多糖的結合能力(由cbm提供)。這兩種功能為重組酶csn75-cbm的進一步純化和固定化提供了可能。
csn75和csn75-cbm的高密度發酵及酶譜分析
重組質粒gs115-ppic9k-csn75 (fig. 3a)和gs115-ppic9k-csn75-cbm (fig. 3b)對高密度發酵液上清液的sds-page分析表明，csn75和csn75-cbm酶是其上清液中的主要蛋白質。酶譜分析用來評價重組酶csn75-cbm對殼聚糖的親和力。粗制和純化的csn75和csn75-cbm在變性sds-page凝膠(fig. 3c)上的條帶與酶譜凝膠(fig. 3d)上的條帶一緻，表明将cbm引入csn75并不影響重組酶對底物的親和力。隻有粗制和純化的csn75和csn75-cbm在酶譜凝膠上顯示出清晰的斑點(fig. 3d)，表明csn75和csn75-cbm是其發酵上清液中僅有的具有殼聚糖酶活性的蛋白質。
csn75和csn75-cbm的酶學性質比較
為了評價融合cbm對csn75酶性質的影響，比較了它們的催化活性、ph和熱穩定性。在醋酸緩沖液(0.2 m，ph 6.0)中，50 ℃時，csn75-cbm的活性為10.26±0.77 u/ml，略低于csn75的活性(13.56±0.86 u/ml)。csn75-cbm的最适ph為5.0，而csn75的最适ph為5.5 (fig. 4a)。csn75和csn75-cbm在ph 4.5-8.0範圍内均表現出良好的催化穩定性，相對活性均在90%以上(fig. 4b)。csn75-cbm的最适溫度為50-60 ℃，略低于csn75(55-65 ℃) (fig. 4c)，表明csn75-cbm的溫度比csn75要溫和。在50 ℃孵育2 h後，csn75-cbm的相對活性仍為82.60%，而csn75的相對活性僅為70.11% (fig. 4d)。
熱凝膠多糖對csn75-cbm的吸附性能
fe-sem分析表明，溶脹的凝膠顆粒(約300 μm)比未溶脹的凝膠顆粒(近10 μm)大得多(fig. 5a, b)。溶脹的凝膠顆粒具有較好的流動性和疏松性，是一種良好的載體。為了進一步證明熱凝膠多糖是否能吸附重組酶csn75-cbm，用clsm對fitc染色的熱凝膠多糖進行了分析。在重組酶csn75-cbm(fig. 5c)處理前，凝膠顆粒表面幾乎沒有綠色熒光，但經重組酶處理(fig. 5d)後，凝膠顆粒表面觀察到強烈的綠色熒光。這表明重組酶csn75-cbm被熱凝膠多糖成功吸附。
為了更好地實作固定化，通過固态耗竭來評估最大吸附容量。重組酶csn75-cbm固定化後，熱凝膠多糖體積增加了5倍(fig. 6a)，填充床呈乳白色(fig. 6b)。固态耗竭實驗表明，csn75-cbm對熱凝膠多糖的吸附曲線符合langmuir吸附等溫式，相關系數r2=0.9777(fig. 6c)。pichia pastoris胞外表達的csn75-cbm (fig. 6d)具有“切割”和“錨定”雙重功能，分别由“csn75”和“cbm”貢獻。這使得csn75-cbm可以一步被熱凝膠多糖提純和固定化(fig. 6e)。将csn75-cbm填充到熱凝膠多糖填充床反應器中，制備了cicpr。殼聚糖在流經cicpr時将被重組酶csn75-cbm水解(fig. 6f)。
固定化csn75-cbm在填充床反應器中的性能
為了在滿足生産要求的同時節約酶的用量，對酶的負載量進行了研究。結果表明，當酶的負載量小于40 u (fig. 7a)時，cicpr不能完全水解底物；而當負載量大于60 u時，chos的dp較接近。是以，酶的可選負載量應為60-100 u，不超過cicpr的最大負載量(200 u)。
作者進一步研究了殼聚糖濃度對水解液中chos聚合度的影響。底物濃度降低會導緻水解物中chos的聚合度降低(fig. 7b)。在連續生産過程中，流量對生産效率有很大影響。随着流速的降低，水解液中chos的聚合度降低(fig. 7c)。這些結果證明，隻要調整工藝參數，cicpr對于連續生産理想的chos是可行的。為了得到具有理想dps的chos，對三種給定條件下的水解物進行了定性和定量測定(fig. 8a, b, and c)。結果表明，在條件Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ條件下，水解液中的主要産物是聚合度為2-5(水解率為97.75%)、3-6(75.45%)和3-7(73.2%)的chos (fig. 8d)。冷凍幹燥後，産品在三種條件下的顔色分别為乳白色、淡黃色和棕黃色(fig. 8e)。cicpr能以理想的dp實作chos的高效生産。此外，該酶的固定化也實作了殼聚糖在cicpr中水解的多相催化。
cicpr的穩定性和可重用性
cicpr的穩定性和可重用性是評價其在連續生産，特别是大規模工業生産中可行性的重要名額。在4 ℃下儲存5、10、15和20 d後，cicpr的催化活性保留率分别為97.8%、95.6%、92.0%和88.3%。20天後，cicpr的催化活性仍保持在88%以上(fig. 9a)。這表明cicpr具有良好的穩定性，有利于其在實際生産中二次應用的靈活性。為了進一步驗證cicpr的可重用性，檢測了還原糖的殘留量(fig. 9b)。結果表明，cicpr在5次循環後仍保持86%以上的水解活性，表明cicpr在實際生産過程中表現出良好的穩定性和可重用性。
為了實作連續生産，進行了補料分批發酵，包括酶的分批補料、平衡和水解三個步驟。用hplc(fig. 9c)和qtof-ms(fig. 9c)檢測水解液中chos的濃度。qtof-ms分析表明，csn75-cbm的水解産物是一種高聚合度殼寡糖，包括(glcn)2(m/z341.16)、(glcn)3(m/z502.22)、(glcn)4(m/z663.29)、(glcn)5(m/z824.36)和(glcn)6(m/z985.43)，和低聚合度殼寡糖，包括(glcn)2-glcnac(m/z 544.24)和(glcn)3-glcnac(m/z705.29) 的混合物。觀察到cicpr在補料分批發酵後可以更新，是以可以連續生産chos。
在這篇文章中，作者利用pichia pastoris細胞外表達了一種cbm融合殼聚糖酶(csn75-cbm)。csn75-cbm表現出比csn75更高的熱穩定性，并具有與熱凝膠多糖特異結合的能力，使一步純化和固定化成為可能。基于這一功能，建立了固定化csn75-cbm填充床反應器(cicpr)，用于連續生産具有理想dp的chos。通過調整酶與殼聚糖的比例或殼聚糖的流量，連續生産出聚合度為2~5(水解率為97.75%)、3~6(75.45%)、3~7(73.2%)的殼聚糖。cicpr的良好穩定性和可重用性使其有可能大規模應用于實際生産，并将極大地降低下遊生物工藝的成本，也将為酶催化連續生物合成綠色化學品或生物降解環境污染物提供更多的啟示。
整理：孫骁
文章資訊：
pmid：34561008
doi：10.1016/j.carbpol.2021.118609
文章連結：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.118609