原理簡介
Fields在1989年提出了酵母雙雜交技術，打開了蛋白質互相作用篩選的快捷通道。這項技術的産生是基于對真核細胞轉錄因子特别是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。GAL4包括兩個結構域，即位于N端的DNA結合域（DNA binding domain，BD）和位于C端轉錄激活域（Activation domain，AD）。BD能夠識别位于GAL4效應基因（GAL4-responsive gene）的上遊激活序列（Upstream activating sequence，UAS），并與之結合，AD可以啟動UAS下遊的基因進行轉錄。BD和AD單獨分别作用并不能激活轉錄進行，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下遊啟動子，轉錄啟動子下遊基因并使其表達。
在酵母雙雜交系統中，BD與X蛋白融合，AD與Y蛋白融合，如果X、Y之間形成蛋白-蛋白複合物，AD與BD會在空間上充分接近，重新構成結構域，啟動報告基因序列的轉錄。擁有BD質粒的酵母菌可以在某一缺陷培養基上生長，擁有AD質粒的酵母菌可以在另一種缺陷培養基上生長。通過接合（mating）或共轉化使酵母菌同時擁有AD與BD質粒，如果BD上的誘餌蛋白與AD上的目的蛋白存在互相作用，這樣的酵母菌株可以在三缺及四缺的培養基上生長，并啟動β-半乳糖苷酶的基因進行轉錄。
圖 酵母雙雜原理
01 酵母雙雜交出現假陽性的原因？如何解決？
可能原因：
根據酵母雙雜交的原理，若BD融合的誘餌蛋白有單獨激活作用，或者其激活作用能被外來蛋白激活，進而激活下遊報告基因的表達，最終會導緻假陽性。是以，在進行實驗時需要作嚴格的對照實驗，對誘餌和靶蛋白分别作單獨激活報告基因的鑒定，以排除假陽性。
解決方法：
（1）可以選擇多個報告基因（HIS，ADE，MEL1）進行更為嚴格的篩選，每個報告基因的上遊調控區各不相同，進而大大減少假陽性；
（2）通過适當提高AbA或3-AT的濃度；
（3）報告基因整合到染色體上，可以使基因表達水準穩定，消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水準波動而造成的假陽性。
02 獲得的陽性克隆，PCR檢測有多條片段。
可能原因：一個酵母細胞可以包含多個捕獲蛋白。
解決辦法：選取單克隆劃闆2-3次，進行藍白斑篩選，直到沒有分離，找到陽性克隆，用于後續的實驗。
03 誘餌蛋白具有自激活活性，能夠單獨激活報告基因的表達怎麼辦？
（1）有些較弱的自激活作用可以通過添加适量的3-AT進行抑制，若較高的3-AT不能抑制自激活則需要對誘餌蛋白進行截短表達。
（2）若該蛋白是一個轉錄因子，具有轉錄激活域，則需要去掉轉錄激活結構域；如果不是轉錄因子但仍具有較強的轉錄激活活性，需要将誘餌蛋白具有激活活性的區域去除，再進行後續的操作，但這樣操作有可能影響蛋白間的互作。
（3）可以考慮換用Co-IP技術進行互作蛋白的鑒定，該技術不受誘餌蛋白自激活的限制。
自激活檢測的主要作用有兩個：其一，需要根據誘餌蛋白自激活的程度調整AbA的濃度或3-AT的濃度；其二，檢測誘餌蛋白是否具有毒性，如果菌落生長過慢，則表達的蛋白可能具有毒性，需要使用低拷貝的質粒表達誘餌蛋白。
04 核體系文庫和膜體系文庫如何選擇？
如果誘餌蛋白定位在膜上或含有跨膜結構域則選擇膜體系文庫，如果誘餌蛋白定位在細胞核中則選擇核體系文庫。有跨膜區的誘餌蛋白也可考慮去除跨膜區或者選用定位在胞内的區域使用核體系文庫進行篩庫，但是這樣做可能會影響目的蛋白的結構與功能，存在一定風險。
蛋白跨膜結構可以使用以下網站進行預測：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
05 膜系統酵母雙雜篩選如何選擇誘餌載體？
膜系統酵母雙雜根據誘餌基因的蛋白跨膜方式可以選擇不同的載體，确定誘餌基因的蛋白結構以後根據下面的表格可選擇适當的載體：
下面提供幾個分析蛋白結構的網站：
（1）分析膜蛋白的細胞内和細胞外區域的網站：
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/
（2）具體分析蛋白的信号肽序列，以及N端是否存在cleavge site的網站：
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
06 酵母雙雜交的篩選流程？
（1）先分析目的蛋白的結構，判斷是否為膜蛋白或者是否有跨膜結構，如果有跨膜結構則需要根據具體蛋白結構選用合适的誘餌載體，如果無跨膜結構一般用pGBKT7誘餌載體；
（2）将目的基因建構至誘餌載體後轉化酵母進行自激活檢測與毒性檢測，根據自激活檢測結果确定合适的篩選條件；
（3）将cDNA文庫質粒轉化至菌株中，塗布在合适的篩選平闆中培養4-7 d，從篩選平闆中挑取陽性克隆點闆于四缺闆中再次确認與誘餌蛋白互相作用的蛋白；
（4）對篩選得到的陽性酵母菌株用通用引物進行cDNA片段擴增與測序，并對該片段的編碼序列在genebank中進行比較，研究其與已知基因在生物學功能上的聯系。
07 雜交效率不高怎麼辦？
酵母文庫篩選可以用Mating以及質粒轉化兩種方法。
Mating是指将誘餌菌液（pGBKT7-Bait/AH109）與酵母文庫Y187菌液混合後進行培養。Mating效率不高，可能是雜交細胞數量不夠，對誘餌菌株進行液體培養過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養，适當增加誘餌蛋白的液體培養量，并保證酵母文庫工作菌液滴度在10^8 CFU/mL以上，同時，還可以延長雜交時間，直至通過顯微鏡鏡檢觀察到存在三葉草形狀的合子産生，再進行後續操作。
質粒轉化效率低可以采用以下方法解決：
（1）檢測文庫質粒DNA的純度，如果可以的話，考慮重新用乙醇純化；
（2）DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的；
（3）配制新鮮的配養基，并做對照轉化；
（4）嚴格按照操作說明書進行操作。
08 3-AT的篩選濃度怎麼選擇，有沒有建議的使用濃度範圍？
正常情況下HIS基因會有輕微洩露，導緻沒有互相作用的克隆也能在三缺平闆上微弱生長，這種情況可以通過添加适量的3-AT進行抑制。理想情況 10mM濃度的3-AT平闆會有少量酵母生長，20mM濃度的3-AT不能或極少有酵母生長。如果在80mM濃度的3-AT平闆上還能生長酵母，說明誘餌蛋白的自激活活性太高，不能用于雙雜交篩選。
09 誘餌蛋白的大小是否對酵母雙雜交的結果有影響？
雖然文獻報道從8-750個氨基酸都有酵母雙雜交成功的案例，但是分子量比較大的蛋白在酵母中可能存在折疊錯誤的情況，是以，在實際的工作中，分子量比較大的誘餌蛋白在酵母中尋找互作蛋白的成功率會低于中等大小分子量的誘餌蛋白。
10 篩選培養基上克隆太多。
可能原因：誘餌蛋白可能存在自激活，自身就可以激活下遊篩選标記的表達；或者是篩選條件過于寬松。
解決辦法：選用更為嚴格的篩選條件抑制誘餌蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除誘餌蛋白能夠引起自激活活性的結構域，再用于酵母雙雜交進行實驗。
11 篩選培養基上克隆太少。
可能原因：酵母雙雜交效率低、篩選條件太嚴格或與目的蛋白互相作用的蛋白太少。
解決辦法：延長雜交時間，提高雜交效率；放寬篩選條件；與目的蛋白互相作用的蛋白太少是誘餌蛋白本身結構造成的，無法通過實驗來彌補。
12 酵母雙雜與酵母單雜的文庫可以共用嗎？
對于核文庫，酵母單雜與酵母雙雜的文庫可以共用，它們的建構方法是一樣的，隻是酵母單雜的誘餌基因是核酸，一般是啟動子序列，而酵母雙雜的誘餌基因是蛋白。
伯遠生物可提供以下技術服務
酵母建庫及篩庫
酵母單雜
酵母雙雜
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