2020年諾貝爾化學獎授予了兩位研究CRISPR / Cas9的科學家，以表彰他們對下一代基因編輯技術和分子機制研究所的發展的貢獻。CRISPR/ Cas9基因編輯技術被認為是21世紀最重要的生物學發現之一。由于其穩定性和效率，CRISPR/Cas9技術已成為基因組編輯的強大工具，在生命科學的各個領域顯示出廣闊的應用前景，并為疾病的治療提供了新的政策。本文綜述了兩位科學家對CRISPR/Cas9基因編輯系統開發的重要貢獻，并簡要介紹了基因編輯技術的發展與應用。
2020年諾貝爾化學獎正式宣布，法國生物化學家Emmanuele Charpentier和美國生物學家Jennifer A. Doudna因其對基因編輯方法發展的變革性貢獻而獲得該獎項（圖1）。值得注意的是，這是諾貝爾化學獎首次同時頒發給兩位女科學家。事實上，早在2016年，她們就憑借研發的基因編輯工具CRISPR/Cas9獲得了歐萊雅聯合國教科文組織世界傑出女科學家成就獎。
1 獲獎者簡介和主要貢獻
Carpenter，1968年出生于法國，1995年在法國巴斯德研究所獲得博士學位，目前是德國馬克斯普朗克病原體科學研究所所長。在她早期的博士後階段，她在五個國家的九個不同的機構工作，并一直在研究細菌控制系統來控制它們的基因組。它的主要貢獻是發現了一種非常豐富的新型小RNA：反式CRISPR RNA（tracrRNA），它證明了它對CRISPR系統的參與，以及對CRISPR系統的成分的分析，它由三種成分組成：tracrRNA，CRISPR RNA和Cas酶。此外，Carpenter還展示了tracRNA和CRISPR RNA之間的互相作用，以引導Cas9進入病毒序列，進而描述了crispr系統的工作原理。
Dudner，1964年出生于華盛頓特區.C，1989年在波士頓哈佛醫學院獲得博士學位，現在是加州大學伯克利分校的教授和霍華德休斯醫學院的研究員。早年，Dudner與Jack Szostak合作開發了RNA剪刀。在科羅拉多大學進行博士後研究時，她解決了核酶的晶體結構。在她自己的實驗室中，她鑒定了各種RNA蛋白複合物，例如内部核糖體入口點和microRNA加工複合物。此外，Dudner一直在研究 Crispr 序列及其工作原理，她使用晶體學和制冷鏡解決了 I 型 CRISPR 系統的 Cascade 複合組分的組成問題。其主要貢獻是與Carpenter合作研究CRISPR系統，分析CRISPR系統應用于基因編輯領域的分子機制，首次揭示在CRISPR基因編輯系統試管中精确切割DNA的可行性，并發現CRISPR和Cas9酶的組合，可以像手術刀一樣， 靶DNA雙鍊可以精确切割。此外，它們簡化了遺傳剪刀的分子組成。從那時起，CRISPR被廣泛應用于基因編輯，開創了一個新時代。
照片 Emmanuel Carpenter（左）和 Jennifer Dudner（右），2020 年諾貝爾化學獎得主
2 CRISPR的發現曆史
2.1 故事的開始：地中海一側的神奇發現
crispR基因編輯系統的故事可以追溯到30年前，在一個名為聖波拉的地中海小鎮，弗朗西斯科·莫希卡（Francisco Mojica）研究了一種癡迷于鹽的古老細菌，發現在這些微生物的基因組中，存在一個多拷貝重複序列，其中約有30個堿基被36個堿基的序列隔開，這與任何已知的微生物組重複序列家族不同。對于這個有規律的重複序列，Moika給它一個詞"定期插入規律聚集間隔回聲重複"，或簡稱CRISPR。
2.2 CRISPR/Cas是一種适應性免疫系統
為了解析清脆序列的功能，Moyka将她的注意力從重複序列轉移到分隔它們的間隔序列，試圖做出新的發現。最後，在2005年，經過許多科學家多年的努力，結合生物資訊學序列比較方法，Moika發現大多數間隔序列與已知序列相似，或者與病毒或與攜帶間隔的微生物相關的整理質粒相比對。基于此，Moika意識到這種CRISPR序列很可能與細菌的獲得性免疫有關。
crispR系統可以承受外來DNA入侵的假設最終在2007年得到證明。當研究人員研究與熱相關的鍊球菌感染噬菌體時，他們發現耐藥細菌獲得了新的間質序列，這些序列與用于在受感染噬菌體中選擇抗性的序列相比對，并且間隔區域的缺失将導緻抗性喪失。此外，Cas的一個基因（Cas5）的失活是相同的，導緻噬菌體抗性的喪失。是以，Cas基因産物在CRISPR/Cas系統介導的免疫中起作用，系統的特異性取決于間隔序列。換句話說，CRISPR系統實際上是細菌的适應性免疫系統。
2.3 切割DNA的神秘剪刀
對CRISPR功能的進一步了解來自對大腸杆菌的研究。它含有一個1類CRISPR/Cas系統，編碼至少8種不同的Cas蛋清，其中5種可以純化為多蛋白複合物，CRISPR與抗病毒防禦相關。這種蛋白質複合物已被證明在crRNA前處理過程中起作用，切割重區的長轉錄本以産生含有病毒的短crRNA分子到源序列。成熟的crRNA分子将借助Cas3編碼的脫氧酶作為引導分子，允許Cascade幹擾噬菌體增殖，進而發揮免疫作用。
但是，如果間隔序列導緻比對序列的DNA斷裂，他們如何避免切割其更清晰的間隔序列？換句話說，他們如何識别自己和他們的差異？這個問題的答案來自對原始間隔序列的接近序列的研究，即噬菌體基因組産生間隔的序列。這種短序列堿基序列僅存在于距離原始間隔序列僅幾顆核苷酸的位置，稱為原始間隔序列區間基序PAM）。進一步的研究發現，許多對CRISPR免疫有抗性的PAMs已經發生突變，是以這種PAM在靶向中起着重要作用。
分析Crispr系統作用機制的最後一步始于在Carpenter中發現一種稱為反式CRISPR RNA（tracrRNA）的小RNA。這種小RNA是從CRISPR基因位點旁邊的序列轉錄而來的，其中25個堿基幾乎完美地補充了CRISPR重複序列。這種互操作性表明tracRNA和crRNA前體雜交在一起，并由RNase III切割為成熟産物。基因實驗也證明了這樣一種觀點，即tracRNA對于加工crRNA至關重要，是以對CRISPR至關重要。從那時起，crispR/Cas免疫系統的工作機制得到了徹底的分析，其防禦機制由三個主要階段組成：第1階段，其中外星噬菌體或質粒的基因的小片段被整合到宿主CRISPR序列中;也就是說，當crRNA識别并與進入質粒或病毒DNA的區域特異性配對時，Cas核酸酶開始靶向切割。
随着Cas9核酸酶，crRNA和tracRNA的出現，這是crispr-Cas9幹擾系統的重要組成部分，該領域的研究已經達到了一個關鍵的裡程碑。
揭開謎團：CRISPR/Cas9基因編輯的分子機制
2012年8月，Dudner和Carpenter合作進行了一項關鍵實驗，揭示了CRISPR/Cas9技術用于基因編輯的分子機制。他們使用重組Cas9（一種來自大腸杆菌中表達的化膿性鍊球菌的基因）和crRNA和tracRNA的體外轉錄來證明Cas9可以在體外切割純化的DNA，并且tracRNA對于處理和搜尋靶DNA的crRNA非常重要，是以可以将其視為由兩個RNA與Cas9蛋白互相作用形成的監測系統， 其中Cas9蛋白的兩個核酸酶結構域就像兩把剪刀，切割DNA後在靶區用雙螺旋擰緊。在了解了工作機制之後，他們試圖通過将crRNA和tracRNA組合成單個引導RNA（sgRNA）來進一步簡化系統，一端有一個靶序列要搜尋，另一端有一個序列要與Cas9結合。通過改變包埋sgRNA的序列，CRISPR/Cas9可以靶向和切割靶DNA序列，隻要靶序列附近存在合适的PAM。是以，他們建立了一個簡單的CRISPR系統，其中包含兩組含有sgRNA和Cas9的核苷酸癌癌酶，可以對其進行程式設計以任意切割目标DNA序列。
值得一提的是，同期立陶宛科學家Ofijus Siksnys也證明了CRISPR是一種RNA引導的藤核心酸，并解析了分子機制，略早于Carpenter和Dudner的結論，但送出過程并不那麼順利。是以，當時清脆領域的競争非常激烈，但正是這種競争推動了科學的進步。
圖2 crisp/Cas9基因編輯系統的分子機制
3 在哺乳動物細胞中實作基因編輯
自從發現CRISPR是一種可設計的限制性内酶以來，研究人員已經意識到，如果CRISPR可以在喂養動物細胞中發揮作用，它可能是切割和編輯基因位點的強大工具。但是，這一假設很難實作。與微生物不同，哺乳動物細胞具有更複雜的内部環境，基因大1000倍，主要集中在細胞核内的色成形結構中。第一位使用CRISPR編輯哺乳動物細胞基因組的中國科學家是來自美國的中國科學家張峰。2011年2月，張峰聽完報告後立即被CRISPR所吸引，并開始研究crispr/Cas9用于編輯哺乳期細胞。通過優化密碼子和核定位信号，張峰獲得了由Cas9、tracrRNA和CRISPR陣列組成的強大三部分系統。靶向人類和小鼠基因的16個位置，發現Cas9系統可以有效而準确地改變哺乳動物細胞中的原因。Cas9切割靶DNA後，細胞可以通過非同源重組末端連接配接修複機制引起堿基缺陷，或者在同時導入修複模闆時通過同源重組依賴性修複方法實作堿基突變或序列插入。此外，張峰還發現，卡彭特和杜德納實驗中描述的短sgRNA在體内融合效果較差，而全長融合提高了效率。哈佛大學進階教授喬治·丘奇（George Church）同時研究了哺乳動物細胞中的CRISPR基因編輯，他發現短融合在身體環境中是無效的，而全長融合效果很好。Church對7個靶點的靶向證明，非同源重組末端連接配接和同源重組修複了CRISPR介導的哺乳動物細胞。張峰和丘奇的研究論文于2013年發表在《美國科學》雜志上。從那時起，研究人員很快發現CRISPR不僅可以用于哺乳動物細胞，還可以用于動物模型，使研究人員能夠在幾周内建立複雜的遺傳疾病或肺癌小鼠模型。此外，CRISPR系統可用于全基因組篩選，以發現生理過程中的關鍵調節基因。此後，CRISPR的力量逐漸被挖掘出來，科學界對CRISPR技術的研究進入了火熱階段。在一年之内，研究人員在幾個物種中使用了CRISPR基因編輯技術，包括酵母，線蟲，果蠅，斑馬魚，小鼠和猴子。
4 基因編輯技術的曆史
使用基因編輯治療疾病或改變性狀的想法至少可以追溯到20世紀50年代DNA雙螺旋結構的發現。當時，研究人員意識到，DNA的大部分堿基序列都是從父母穩定地傳遞給後代的，并且序列的微小變化可能意味着健康和疾病之間的差異。他們希望通過識别導緻遺傳疾病的DNA突變來預防或逆轉這種疾病。然而，事實證明，開發用于基因治療的基因編輯技術非常困難。最早的基因編輯技術出現在1986年，當時托馬斯和其他人成功地将耐藥基因引入新黴素耐藥的缺陷細胞中，使它們能夠重新獲得抗藥性。該技術主要得益于基因的同源重組修複機制。
随着基因編輯技術的發展，研究人員發現了人工鋅指核酸酶（鋅指核酸酶，ZFN）技術和轉錄激活劑效應核酸酶（TALEN）技術。ZFN是一種合成融合蛋白，由特殊鑒定的DNA鋅指蛋白（鋅指蛋白，ZFP）和FokI核酸内裂解酶的剪切結構域組成。當鋅指蛋白連接配接到核酸酶結構域時，鋅指蛋白可用作位點特異性核酸酶，以序列特異性方式切割基因組DNA。
與ZFN類似，TALEN由特别鑒定的故事蛋白融合而成，這些蛋白将DNA與FokI結合。核酸内酶。Tale蛋白是從植物病原菌黃色單核細胞細菌中分離出來的一類效應蛋白。TALEN的DNA結合模式與ZFN的不同之處在于，ITEN以子產品化方式識别DNA，并且可以摻入核酸酶結構域中。雖然ZFN和TALEN都編輯了廣泛的細胞和生物體，但它們的廣泛使用受到蛋白質設計，合成和驗證難度的限制。
由Carpenter和Dudner定義的CRISPR雙組分系統可以快速程式設計為靶DNA的序列特異性切割，進而引發基因組編輯的革命。CrispR/ Cas9是使用最廣泛的基因編輯技術，由于其設計簡單且隻需要兩個部分：sgRNA和Cas9酶，是以被生命科學各個領域的越來越多的研究人員使用。
自CRISPR/Cas9基因編輯技術誕生以來，科學家們對它進行了大量的優化和修改。一方面，今天的CRISPR基因編輯技術可以變得更加準确，進而減少脫靶效應，另一方面，CRISPR系統已經超越了DNA，能夠有效地編譯RNA。除了來自化膿性鍊球菌的Cas9外，還發現了許多新的Cas同源物。例如，張峰在2015年發現的Cpf1蛋白可以克服CRISPR/Cas9系統應用的一些局限性。例如，與Cas9的平端切割方法不同，Cpf1切割産生粘性末端，使其更容易插入DNA，并且隻需要crRNA，而不需要tracRNA，這豐富了CRISPR系統的使用。此外，廣泛使用的CRISPR/Cas系統通常是NGG PAM，這極大地限制了它的應用，是以研究人員突變了Cas9蛋白以改變PAM相容性，甚至将其擴充到沒有PAM限制的全堿基組編輯。
第一代CRISPR技術涉及DNA雙鍊斷裂，這經常在DNA雙鍊位點插入缺失，轉譯等突變，這帶來了潛在的風險，并且在沒有同源模闆的情況下是不精确的。為了開發更準确的基因編輯系統，研究人員将注意力轉向了單個堿基中的突變，開發了一種基于傳統CRISPR的單堿基編輯系統，試圖實作準确的單堿基變異。2016年，堿基編輯系統的發展将CRISPR/Cas系統從用于切割DNA的"剪刀"轉變為可以重寫特定堿基的"校正器"，為精确的基因編輯打開了大門。目前，廣泛使用的基礎編輯系統主要是胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器，分别可以實作C>T和A>G轉換。
近年來，一種稱為"素編輯"的新型編輯工具被建立出來，由Cas9 H840A切口酶和逆轉錄酶融合，與修飾的引導RNA（pegRNA）相結合，将編輯蛋白引導到靶位點并包含編輯的模闆序列。Cas9切割靶位點後，用pegRNA作為模闆逆轉逆轉逆轉錄酶，然後根據模闆修複DNA鍊。這是一種"搜尋和替換"基因組編輯技術，可介導靶标插入，缺失和所有堿基替換，但效率尚未提高。
5 基因編輯技術的應用
基因編輯技術自發展以來，在生命科學領域得到了廣泛的應用，不僅大大加快了基礎研究的程序，而且在農業和合成生物技術方面取得了突破。在科學研究領域，該技術可以快速構模組化型動物，節省了大量的研究時間和金錢，在農業方面，植物研究人員已經開發出可以抵抗黴菌，害蟲和幹旱的作物，而在醫學領域，基因編輯技術将用于滅活或修改患者的緻病基因，為遺傳性疾病患者提供挽救生命的治療方法。
源自基因編輯技術的基因療法在臨床治療中也顯示出其優勢。目前，全球共有16種基因治療藥物（包括CAR-T藥物）獲批銷售，涵蓋癌症、地中海貧血和部分單堿基遺傳病等多種适應症。目前，全球範圍内正在進行幾項與基因編輯相關的臨床試驗。以β地中海貧血為例，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，在地中海貧血和鐮狀貧血患者幹細胞中編輯了β BCL11A增強亞位點，使得患者體内γ珠蛋白基因再激活表達，可以彌補自生幹細胞移植後β珠蛋白蛋白的缺陷， 能使機體分化産生高比例的胎兒血紅蛋白（HbF）和正常功能的血紅蛋白紅細胞，進而有可能徹底治愈這類疾病。這些臨床試驗已于2018年獲得FDA準許，由制藥公司Vertex / CRISPR therapeutics上司，是美國和歐洲針對β型貧血和鐮狀細胞病的I / II期臨床試驗。2020年初，另一項研究表明，地中海貧血和鐮狀貧血可以用新一代單堿基編輯器治療。我國"貧困"基因攜帶者約3000萬人、異基因造血幹配困難和血庫資源不足等問題嚴重影響了患者的治療，新的基因治療顯然給他們帶來了新的希望。
此外，crispR/Cas9系統可用于靶向免疫細胞中的惡性良性腫瘤免疫測定分子，或利用特定的表達元素，這有望增強惡性良性腫瘤免疫的治療效果。相關的臨床研究仍在進行中。
随着近年來基因編輯技術的飛速發展，分子生物學、生物技術領域迎來了新一代，從CRISPR/Cas9開始到衍生的單堿基編輯、RNA編輯工具，讓我看到了這些新興科技在基礎研究、藥物靶點發現、作物修飾和臨床治療方面的巨大潛力。
6 基因編輯背後的思考
最後，需要強調的是，CRISPR/Cas9技術如果不加以使用和規範，也會造成嚴重的倫理和社會問題，是以嚴格控制該技術的使用範圍并制定相關法律法規非常重要。為此，世界衛生組織最近成立了一個全球多學科專家小組，研究與人類基因組編輯相關的科學、倫理、社會和法律挑戰，研究人員建立了指導人類基因組編纂的全球架構。是以，利用基因彙編技術進行疾病研究和治療必須在法律許可範圍内進行。
綜上所述，自沃森和克裡克在1953年發現DNA的分子結構以來，科學家們一直在努力操縱DNA，而這一點終于在幾代優秀研究人員的不懈努力下實作了。自2012年Carpenter和Dudner發現CRISPR/Cas9基因剪刀以來，CRISPR技術已迅速在全球推廣并應用到廣泛的領域，産生了許多科學創新，特别是在遺傳病治療、疾病相關基因的篩選和檢測、惡性良性腫瘤治療和動植物修飾、病原微生物控制等領域顯示出巨大的潛力。CRISPR/Cas9系統開創了生命科學的新時代，正如諾貝爾化學委員會主席克拉斯·古斯塔夫森（Claes Gustafsson）所說，"這種基因編輯工具具有影響我們所有人的強大力量。它不僅在基礎科學上具有革命性，而且還生産了新的作物，并将導緻突破性的新療法。"這就是這項技術的吸引力，是以2020年諾貝爾化學獎對CRISPR基因編輯技術發展的影響必須是深遠而重大的。