β-内酰胺類藥物（β-内酰胺類藥物）是指一大類抗生素中含有β-内酰胺環的結構，按母核結構的差異可分為青黴素、頭孢菌素、碳青黴素和單環β内酰胺等主要類，其中青黴素類藥物和頭孢菌素類藥物在獸醫臨床應用中最為廣泛。本部分總結了β端酰胺類藥物的結構和分類、理化性質、藥理學研究、毒理學研究、國内外限量要求，以及殘留物檢測樣品預處理、儀器測定方法等，以期為全面了解此類藥物和殘留物檢測提供參考。
1 結構和分類
1.1 結構
β-内酰胺型藥物結構含有β-内酰胺母核四環結構，這在天然産物中很少見，是此類抗生素的代表性特征。青黴素和頭孢菌素是使用最廣泛的，其結構特征如圖5-39所示。
（1）基本結構由母芯和側鍊組成。母核包含一個四元β端酰胺環，其通過氮原子及其相鄰的三個碳原子，随着第二個五環或六環變厚。青黴素的增稠環為鹽酸鹽環，母核結構為6-氨基青黴素酸（6-氨基青黴素酸，6-APA）;
（2）C6或C7位含有基于芳酰胺的側鍊（RCONH-），它通常是側鍊的連接配接點。
（3）母核結構有2個不共沸的緻密環，青黴素類沿N1-C5軸折疊，頭孢菌素類沿N1-C6軸折疊。
（4）青黴素樣細胞核含有3個奇麥爾碳原子，8個旋轉異構體隻有2S、5R、6R活性的絕對構型，是以完全合成非常困難;
普通β内酰胺類藥物的化學結構如表5-28所示。
1.2 分類
1.2.1 青黴素類藥物的分類
青黴素藥物分為天然青黴素和半合成青黴素，從微生物發酵液中提取的天然青黴素，包括青黴素F、青黴素G、青黴素X、青黴素K和雙氫青黴素F5成分，其中青黴素G含量最高，療效最好;
根據青黴素類藥物的抗菌譜，分為五大類，第一類主要用于抗非産β酰胺酶革蘭氏陽性菌，包括葡萄球菌、鍊球菌、孢子菌等引起的感染，屬于窄譜青黴素，代表抗生素有青黴素G（注射）鈉鉀鹽、青黴素V（口服）、青黴素、青黴素等;第三類是耐青黴素的青黴素，對青黴素酶穩定，主要用于各種抗生産酶引起的葡萄球菌感染，其抗菌譜窄，代表抗生素如毒死蜱、二毒死蜱、苯二氮卓類、氟毒死蜱等;假單胞菌的活性廣譜青黴素，代表吡啶、四辛、吡拉西林、阿洛西林、美洛西林等抗生素，第五類是青黴素，主要作用于革蘭氏陰性菌，對大腸杆菌隻有良好的作用。抗菌譜窄，代表抗生素如蟒蛇、蟒蛇、他莫西林等。
1.2.1 頭孢菌素類藥物的分類
頭孢菌素類藥物均為半合成藥物，主要合成方法是在母核結構中引入R1、R2位的不同側鍊基團，按合成時間順序可将頭孢菌素類藥物分為四代。第一代頭孢菌素對青黴素酶穩定，但對大多數革蘭氏陰性菌的耐藥性較差，β，包括頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素和頭孢菌素等藥物。第二代頭孢菌素，包括頭孢菌素、頭孢菌素等，已經生産出相對較少的藥物，近年來逐漸在醫學臨床上得到應用，但在動物臨床應用中卻很少。第三代頭孢菌素含有較多的種類，臨床常用藥物有頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素等，這些藥對β-cylamide酶、厭氧菌和革蘭氏陰性菌均有顯著作用。第四代頭孢菌素具有廣譜、高效、β-endamide酶的高度穩定性，主要用于治療持續性傳染病，包括頭孢菌素、頭孢菌素等。其中，第三代頭孢菌素和第四代頭孢菌素都是動物專用藥物，效果确有。
2 實體和化學性質
β-内酰胺類藥物在水中和油性有機溶劑中的溶解性較差，是以臨床藥物多為鉀鹽或鈉鹽，鹽類可溶于水、乙炔、甲醇和乙醇等極性溶劑，外觀為白色結晶或粉末狀，無味或有異味，具有不同程度的吸濕性。β酰胺類藥物多為旋風，青黴素型藥物缺乏紫外線吸收性能，其紫外線吸收通常來自苯環的側鍊，特性不強;
青黴素類藥物和頭孢菌素在藥物結構中含有羧基，屬于有機酸，其pKa一般為25~28，表現出較強的酸度，而母環具有可質子化的萼胺位點，是以分子一般表現出一些性别化合物的特征。β-内酰胺環是藥物結構中最不穩定的部分，當與堿、酸、重金屬（氧化劑）和酶互相作用時，會發生水解反應和分子重整，導緻藥物失效。目前，關于青黴素G降解反應的研究和報道較多，青黴素G能穩定在幹燥狀态，在水溶液中易代謝，酸能産生二酸青黴素、青黴素等β-國産酰胺藥物殘留，堿、醇或酶可産生青黴素和青黴素等物質。其中，青黴素可以聚合成青黴素聚合物，可以與肽或蛋白質結合形成快速的毛發過敏原，青黴素G是人體過敏反應的主要原因。
3 作用機制
Β-内酰胺類藥物具有相似的作用機制，通過抑制細胞壁粘膜肽合酶的産生，幹擾細胞壁肽多糖的合成，使細菌細胞壁斷裂，細菌擴張破裂死亡。β内酰胺類藥物通過抑制肽聚糖轉肽酶來抑制細菌細胞壁的合成。棒狀肽是細菌細胞壁的主要成分，是一些網狀結構的含糖多肽，是由N-乙酰谷氨酰胺和N-乙酰基壁氨基酸交替組成，由線性多糖鍊肽組成，這些聚合物需要通過粘膜肽催化的跨肽酶轉肽反應，使線性聚合物轉化交易結構， 完成細胞壁的合成。β内酰胺類藥物用于抑制粘膜肽轉肽酶的活性。由于其結構與粘膜肽-D-丙氨酸的末端結構相似，組成相似，使得酶鑒定錯誤。青黴素與酶的活性中樞共價性競争性結合，形成不可逆的抑制作用。由于缺乏酶催化，短肽不能轉化為鍊狀結構，細胞壁不能合成。無細胞壁，細胞不能成形并受到細胞内高滲透壓力，導緻裂解酶和細菌死亡。這一特點有很大的優點，因為人體細胞沒有細胞壁，藥物對人體細胞不起作用，有很大的選擇，是以β内酰胺類藥物都是毒性很大的抗生素。
細胞壁粘膜肽合酶是青黴素結合蛋白（青黴素結合蛋白、PBPs），近年來研究人員證明，細菌細胞膜上的特殊蛋白PBPs是β-endamide藥物的靶标，PBPs的數量不同，細菌細胞膜上的相對分子量、對藥物的敏感性，此外，有報道稱，這類藥物還可以引發細菌自解活性，對細菌有緻死作用。
青黴素和頭孢菌素類藥物種類多，抗菌譜範圍廣，在獸醫臨床上廣泛應用由葡萄球菌、鍊球菌、肺炎球菌、大腸杆菌、沙門氏菌、嗜血杆菌等細菌引起的各類動物傳染病。
4 藥理學研究
4.1 藥物的吸收和配置設定
β酰胺内藥物化學不穩定，易受胃酸和β-endamide酶的影響，除青黴素V、阿莫西林等耐酸小部位外，該藥物可口服，大多數β-endamide藥物通過肌内注射、皮下注射或靜脈注射。一般認為，大多數β端酰胺類藥物的吸收位點在胃腸道内，但體内不同藥物的吸收機制存在顯著差異，Bretschneider等人認為，吸收機制的差異可能與藥物本身的前列腺和腸道轉運蛋白的差異有關，他在跨膜轉運過程的Caco-2細胞單層模型中研究了23種β内酰胺藥物， 肽轉運蛋白Peptransporter1被發現是頭孢菌素羟基孢菌素，頭孢菌素，頭孢菌素，頭孢菌素，氨苄西林等藥物的良好轉運蛋白，但對頭孢菌素等藥物沒有親和力。此外，腸道中的pH差異對藥物的吸收有影響，一般認為哺乳動物腸道中β内酰胺類藥物的最佳pH吸收環境為61~68。
β内酰胺類藥物在體内分布廣泛，肝髒、腎髒和肺部濃度最高，僅次于皮脂和肌肉，腦脊液和乳汁中也是如此。組織發炎和給藥方式的差異可導緻藥物在體内的異常分布，如母乳在乳腺炎治療期間母乳 pH 值升高，血漿乳屏障受損，β端酰胺型藥物易電離乳房灌注是将治療藥物直接注射到的感染部位， 這些特點導緻治療藥物被乳房嚴重吸收，并且随着哺乳和吸收的增加，有報道稱青黴素G在通過乳房灌注治療乳腺炎時，24h母乳中給予的藥物量可達到注射的42.6%。
4.2 藥物的轉化和排洩
β内酰胺類藥物在動物中的半衰期較短，哺乳動物之間的差異較小。牛阿莫西林在奶牛中的消除半衰期為1.5h，狗和貓為0.75~1.5h，氨苄西林在狗和貓中的消除半衰期為0.75~1.3h，豬為1.0h;牛、馬、牦牛、豬和兔肌内注射的半衰期分别為1.02h、2.6h、1.63h、2.56h和0.52h，牛、馬、駱駝、豬、羊靜脈注射，狗和火雞的半衰期分别為1.2h、0.9h、0.8h、0.7h、0.7h、0.5h和0.5h。楊大偉等研究了豬頭孢菌的藥代動力學過程，肌内注射後吸收迅速，達到0.28~0.52h的血藥濃度峰值，消除半衰期1.79~2.77h，結果與奶牛藥理學研究結果進行比較，牛頭孢菌素注射液的消除半衰期為0.3h， 藥理排洩過程的差異不明顯。
β-國産酰胺類藥物進入血液循環，在體内不易被破壞，主要由原型從尿液排洩，梁偉等21種常用β-國産酰胺類藥物排洩途徑，苯二氮卓類、頭孢菌素等主要藥物原型通過腎髒排洩，腎功能下降時半衰期相應延長，吡嗪、頭孢菌素等藥物除由腎髒排洩， 原型的一小部分由肝髒和膽汁系統排洩，并通過膽汁排出到腸道後重新吸收到血液中，形成肝髒和腸道循環。此外，不同的給藥方法和部分藥物都會對藥物的排洩方式産生影響，吡哆醇在治療牛乳腺炎時，口服給藥主要通過腎髒和膽汁排洩，但乳房灌注給藥的量大部分是用母乳排出的。FDA調查顯示，不注意安全用藥時間是牛奶中獸藥殘留的主要原因，牛奶中61%的獸藥殘留是奶牛哺乳期藥物治療造成的，31%來自牛奶幹乳藥物治療。不同的給藥途徑可導緻牛奶中藥物殘留的時間不同。當青黴素G治療奶牛乳腺炎時，在肌肉中以相同劑量和給藥時間施用的奶牛的牛奶中檢測到青黴素G的殘留物，而在通過乳房灌注給藥的奶牛中，通過哺乳排洩青黴素G的時間為144h。此外，藥物在牛乳腺組織中的停留時間也存在差異。在相同給藥方法的情況下，頭孢菌素與牛奶的排出時間為52h，頭孢菌素與乳汁的排出時間為84h，與氯黴素相鄰的乳汁排出時間為96h。
5 毒理學研究
β内酰胺類藥物本身通常毒性低，但含有蛋白質的化合物可能是非常強的過敏性來源，導緻嚴重的過敏反應———過敏反應。
青黴素類藥物在體内的主要不良反應是過敏反應發生率高，在各類藥物中排名第一。據世衛組織統計，青黴素藥物過敏反應發生率為07%~10%。青黴素過敏反應包括快速頭發過敏反應和晚期頭發過敏反應，原臨床表現為過敏性休克、荨麻疹、血管性神經水腫等，是I型介導的超敏反應;其中，過敏性休克最為嚴重，可在短時間内緻命。
根據Dewndycetal的說法，過敏反應是由預先形成的過敏原引起的，例如青黴素 - 蛋白質結合，它們留在動物體内。根據現代免疫學理論，由于過敏原必須具有特定的抗原來确定簇和多價等必要條件，目前臨床應用的青黴素藥物相對于分子量小于1000，是以不具有免疫原性，而是通過與蛋白質、肽、多糖等大分子載體的組合形成完整的抗原或自聚合成多價半抗原， 成為過敏反應的主要原因之一。此外，Brander的研究發現，青黴素直接與T淋巴細胞表面的組織相容性複合物（MHC）肽複合物分子結合，刺激T淋巴細胞的增殖并誘導進一步的反應，而無需抗原呈遞細胞呈遞C.張建民等人研究了在8860例有過敏史的醫院病例中的藥物使用情況， 并發現β端胺類藥物過敏比例最大，青黴素類藥物過敏反應率最高，占總比例的37.8%，頭孢菌素類藥物過敏反應發生率為11.3%。在單一藥物的情況下，青黴素G的過敏反應發生率最高，占青黴素類藥物過敏率的89.4%。
6 國内外有限要求
為了保護消費者的健康和安全，中國、歐盟、美國等國相繼開發了β内酰胺類藥物在動物組織中的OFR，表5-29為我國，歐盟關于動物組織中β内酰胺類藥物MRL的規定。
7 檢測方法
7.1 樣品預處理
樣品的預處理主要包括提取、純化、濃縮（富集）、衍生化等過程，占檢測分析過程總量的近70%。與其他藥物相比，β端酰胺類藥物化學不穩定，易受試劑、溫度等預處理因素的影響，且樣品中藥物殘留濃度低，是以樣品預處理技術對β端酰胺藥物的分析和檢測具有重要意義。
7.1.1 樣品提取
7.1.1.1 提取的液體
提取物的作用是從樣品中提取靶标，在保證目标物質提取效率的前提下，需要考慮基質的幹擾。β-家酰胺類藥物大多通過藥物原型留在動物組織中，母體結構中含有氩堿和質子可堿的膿毒症部位，表現出兩性、中極性或極性化合物的一些特征，可溶于極性有機溶劑和酸性或堿性水溶液。是以，可根據藥物的性質選擇合适的提取物，目前常用β-endamide藥物殘留分析的提取溶劑有乙炔、乙炔酸、酸化甲醇、乙炔二氯甲烷、磷酸鹽緩沖液和鎢鈉。生物樣品中常用的提取溶劑β酰胺藥物殘留物可分為無機試劑提取物和有機試劑提取物。
7.1.1.1.1 無機試劑提取物
β-内酰胺類藥物可溶于酸性或堿性水溶液，殘留分析中選取的無機試劑多為稀酸、緩沖液等。劉偉等動物組織從雞肉、豬肉、豬皮、豬油、豬油等中提取磷脂緩沖液，經HPLC檢測，藥物回收率為70.9%~86.8%。優科等選用鎢酸鈉作為提取溶劑，從牛的腎髒和肝髒中提取7種青黴素藥物，經LC-MS/MS提取試驗後，藥物的回收率高于66%。黃百芬等20%醋酸鉛溶液在牛奶中12種青黴素藥物和7種頭孢菌素藥物進行提取，樣品沉澱後用HLB固相提取柱純化，用UPLC-MS/MS檢測，19種藥物的定量限值可達0.034μg/L，回收率為73.4%~112.7%。
7.1.1.1.2 有機試劑提取物
β-賴酰胺藥物殘留分析廣泛用于甲醇、乙炔、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷等有機溶劑作為萃取劑，這些溶劑具有良好的溶劑作用和滲透能力、提取速度快、脫蛋白脫脂等優點，目前使用的提取試劑較多。甲醇易使β-endamide藥物醇化，影響藥物回收，且甲醇提取物雜質較高，目前使用較少。酸性有機溶液有利于提高一些β端酰胺藥物的回收率，但由于大多數藥物β端酰胺環不穩定性，在酸性溶液中易降解，是以酸性有機溶液隻能用于提取一些穩定的藥物。為了增加萃取器的選擇性，必要時使用混合溶劑，如三氯生甲醇、二氯甲烷-乙炔、乙炔-水等。以神鷹兵等含有25%高氯酸的乙炔溶液為提取劑，從人血漿中提取頭孢菌素，經HPCE檢測，回收率為97.6%~104.5%。DeAlwis等選用甲醇-三氯生酸在酒中對青黴素、氨苄西林等各類抗生素進行提取，藥物回收率為50%~100%。從生物組織中提取的Mieke等β-裂解藥物如氨苄西林、阿莫西林、頭孢菌素、頭孢菌素、美洛賓等增加了提取藥物的種類，但回收率略低（59.9%~71.5%）。Cmara β-萊納米類如氨苄西林、青黴素G、青黴素V、頭孢菌素、二毒死靈、毒死蜱、苯二氮卓類、頭孢菌素、頭孢菌素等在羊奶中用乙炔、5mL羊奶加5mL乙炔提取藥物，節省了提取試劑的用量，但提取器的沉澱效果不好，在用SPE柱純化前，膜過濾需要0.45m。此外，EDTA、磷酸鹽緩沖液等也可用于β-内酰胺型藥物，DeAlwis嘗試使用三氯生-EDTA提取青黴素G、氨苄西林2種藥物，藥物的回收率為50%~100.0%。桑托斯等人用20%的三氯生乙酸溶液在牛奶中提取了阿莫西林等6種藥物，回收率超過72%。以李牧等乙炔為提取劑，從血液和尿液中提取多種頭孢菌素藥物殘留物，經HPLC檢測，回收率高于80%。
為了進一步提高生物樣品中β端酰胺藥物殘留的提取效率，許多研究人員還選擇了不同的實體或化學提取技術，常用的提取技術有均質提取、振蕩提取、超聲輔助提取等。前兩種提取方法是正常技術，而超音波輔助提取主要利用超音波的機械效應、空心效應和熱效應，通過增加媒體分子的運動速度和穿透力來提取待測組分。操作時将适量的生物樣品與提取溶劑混合，借助超音波水浴作用一段時間，選擇合适的超音波強度和超音波時間達到定量提取的目的，這個過程是一個實體過程，在整個提取過程中不會發生化學反應， 不影響大多數藥物活性成分的生理活性，操作簡單，可一次提取多個樣品。張偉等9種牛奶β-endamide藥物殘留檢測，選用乙炔和磷酸鹽緩沖液進行提取，20kHz超聲輔助提取5min，純化用HPLC檢測，所有藥物回收率達71.0%以上。
7.1.2 樣品的純化
由于樣品基質性質複雜，一些性質上與待測組分相似的常見提取物被提取在一起，這些雜質往往會幹擾光譜檢測，增加基線噪聲，降低色譜效率，堵塞色譜線，污染柱和檢測器等，是以在色譜和其他檢測之前純化操作是必不可少的。純化處理方法主要包括液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）兩大類。
7.1.2.1 域名注冊
LLE是一種傳統的純化方法，試驗條件不高，是純化β-endamide藥物殘留的基本方法。該方法在不同溶液中使用不同溶解度的不同物質，使阿德勒從一相到另一相，進而實作樣品的純化。二氯甲烷和三氯甲烷通常用作液液分布溶劑，有時加入氯化鈉以增強溶劑的離子強度，進一步提高β-lyceramide藥物在有機相中的轉移效率。此外，從樣品基質中提取後，通常使用非極性溶劑如正己烷和醚進行脫脂。Jank等人建立了基于LLE和LC-MS/MS組合的快速檢測牛奶中β端酰胺藥物殘留的方法，并用乙炔提取牛奶中的藥物，回收率均超過60%，測試限值符合歐盟标準。
Kukusamude等人還利用十六烷基三甲基溴（CTAB）、TritonX-114等建立了混合膠束的濁度提取方法，并對不同pH值、CTAB、提取時間、Triton濃度、鹽濃度等的濃度進行了詳細的研究（圖5-40）。
LLE是一種經典的純化方法，試驗條件不高，但需要大量的高純度溶劑，提取時間長，回收率不理想。為了提高提取效率，可以同時使用加壓液體提取和超臨界流體提取等輔助提取技術。
從牛奶青黴素G、毒死蜱、苯二氮卓類等三種藥物殘留中提取出四丁基溴铵作為離子還原試劑的藥物，系統分析了不同pH值、不同四丁基溴濃度、不同鹽濃度對離子提取對試劑提取的影響，直接對液液萃取後的上層溶液進行LC-PDA檢測。康德尼等人通過"加壓液萃取"和固相萃取法測定了6種β端酰胺類藥物在動物飼料中的殘留量，并系統研究了影響加壓溶劑提取的因素，如溶液成分、溫度、容器尺寸、萃取循環次數、溶液體積等;從14個市場采集的樣本均采用這種方法進行了測試。
7.1.2.2 SPE
SPE是在LLE的基礎上開發的一種新型純化技術，是樣品預處理的主流純化技術，其原理是利用固體吸附劑吸附目标化合物在液體樣品中，使其與樣品底物和幹擾素分離，然後用溶液洗脫或熱解吸， 達到目标化合物的分離富集目的，目前被廣泛用作樣品的純化方法。SPE可純化小體積樣品，溶劑用量小，選擇性高，可根據不同受試者選擇不同的填料，按固定機構可分為正向固定相、反向固定相和離子交換固定相等。主要包括C18色譜柱、混合離子色譜柱（OasisMAX、CleanertPAX）、親陽離子色譜柱（ProElutSAX）、親水色譜柱（OasisHLB）等。
β-國産酰胺類藥物結構中含有碳蛋白、氨基，通常是極性的，是以這類藥物可以選擇倒置萃取柱，如C18柱和HLB柱等，β-endamide藥物屬于有機酸，根據目标物質的化學性質酸度，有些藥物可以選擇混合陰離子柱。SPE色譜柱的選擇需要根據被測藥物的類型和性質進行測試和篩選。對馬卡羅夫等動物肌肉組織中8種β端酰胺藥物殘留進行了測試，比較了HLB柱、C18柱、MAX柱、ENV柱的純化效果，試驗結果表明，Enrvy柱的純化效果最好，MAX柱的回收率最低，而C18柱保留了最高的阿莫西林儲量， 氨苄西林和青黴素G，但相鄰氯黴素的回收率明顯低于其他提取柱，HLB柱明顯優于MAX柱。但仍低于其他兩個萃取柱，此外，實驗研究了pH值對4個萃取柱保留能力的影響，發現當pH值為5~9時，SPE柱更适合β-endamide藥物。Fernandez-Torres等人比較了C18色譜柱和Plexa固相萃取柱對包括β-lyamide藥物在内的4類藥物的純化效果，并詳細比較了不同pH值、不同洗滌洗脫液的純化效果，結果表明Plexa固相萃取柱優于C18柱。郭德華等已建立獸源食品76種獸藥殘留SPE，樣品采用乙炔和鎂離子檸檬酸緩沖液進行提取，除去有機相以緩沖液重溶，聚合物和陽離子交換SPE柱系列純化，用甲醇和甲醇氨（95：5）逐漸洗脫，用LC-MS/MS測定，用法定量的底物曲線， 回收率為59.4%~115.3%，RSD為2.6%~27.3%，該方法在市場上成功用于篩選樣品。張琦與阿莫西林、頭孢菌素、氨苄西林和青黴素V等标準混合物的HLB柱、C18柱、MAX柱的純化效果進行了對比，結果表明，HLB柱對被測藥物的保留能力最好，4種藥物的回收率均高于70%。在多殘留分析中，藥物的性質存在差異，除了選擇SPE柱的适當保留機制外，為了最大限度地提高SPE柱的保留和純化能力，有必要對SPE柱的純化條件進行測試和篩選。
7.1.2.3 基質固相分散（MSPD）
MSPD是一種類似于SPE的純化技術。Barker等人于1989年首次提出這一技術，使試樣與矽膠反向粘結結合均勻後，研磨、柱，然後選擇合适的洗滌柱，将目标化合物洗脫下來。該方法純化效率高，耗時省溶劑，但實作自動化并不容易。王蓮等人建立了針對畜肉和牛奶中20種獸藥殘留的MSPD純化方法，将生物樣品與C18填料混合均勻，填充到SPE空氣管中壓實，置于SPE裝置上，用甲醇減壓洗脫，洗脫液用40氮氣吹幹，用乙炔-乙酸铵溶解（2∶8， V/V），濾膜樣品，藥物檢測限為0.05~3.05g/kg，回收率70%以上。
7.1.2.4 QuEChERS方法
QuEChERS法是近年來發展起來的用于農産品快速檢測的樣品預處理技術。該方法具有回收率高、結果準确、樣品處理量大等優點，減少了試劑的消耗以及試驗人員與有毒溶劑的接觸，能有效地結合萃取、配置設定和純化，進一步降低萃取步驟，提高萃取效率。QuEChERS法通常主要展現在分散固相萃取中，Pérez-Burgos等建立了檢測7種頭孢菌素藥物殘留的方法，QuEChERS法，牛肉樣品通過15mL甲醇水溶液（8∶2，V/V）振蕩提取離心後，将10mL液體加入到150mgC18和900mg硫酸鎂中不加水， 振蕩5min，離心取5mL液體，用氮氣吹幹，LC-MS/MS檢測後可溶，該方法的定量限為4~50μg/kg，RSD小于15%。Karageorgou等人使用超聲輔助MSPD建立了quEChERS方法，用于檢測牛奶中12種内酰胺類藥物的殘留物。
分子印迹技術
分子印迹技術使用分子印迹聚合物（MIP）作為固定相，對目标分子具有特定的識别能力。王輝等合成青黴素特異性吸附能力的青黴素特異性印迹聚合物PenG-MIP，MIP用于檢測牛奶中的青黴素，實作分子印迹技術對牛奶中青黴素殘留物的快速定量檢測，檢測限為5 sg/L，精度高，操作友善，且PenG-MIP顆粒可反複使用，大大降低了檢測成本。
7.1.2.6 免疫親和色譜（IAC）
IAC是一種基于抗原抗體特異性、可逆免疫結合反應的色譜技術。在純化過程中采用抗體連接配接的惰性基質固定相，特異性好，選擇性高，是生物樣品的有效純化方法之一。Zhi等人建立了自動流動電流免疫測定系統，定量測定了牛奶中頭孢菌素的殘留量，檢測限為1 μg/L，定量限為3 μg/L，均低于歐盟标準規定的牛奶中頭孢菌素的MRL。該方法對頭孢菌素選擇性高，其他頭孢菌素和青黴素類藥物對其檢測幹擾小，适用于牛奶中頭孢菌素殘留的定性和定量分析。IAC特異性好，選擇性強，在藥物分析中具有廣闊的前景，但由于免疫方法的局限性，應用不廣泛。
7.2 檢測方法
國内外已有多篇關于β端酰胺藥物殘留檢測技術的報道。目前，用于檢測β酰胺藥物殘留的方法有高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）、液相色譜-質譜（LC-MS）、氣相色譜（GC）、免疫測定、微生物學等。
7.2.1 氣相色譜
GC是以氣體為流動相的色譜工藝，适用于氣體，沸點低，物質易汽化，而β酰胺藥物本身不易汽化，需要在預處理過程中衍生出來。Meetschen等人利用GC測定了7種β-endamide藥物在動物組織中的殘留，并用重氮甲烷衍生出它們以形成揮發性青黴素甲酯，回收率為46.0%~73.0%。GC要求樣品能夠汽化，受樣品揮發性限制，大多β端酰胺藥物揮發性和熱不穩定性，雖然可以使用一些預處理方法，但操作難度增加，工藝複雜，并且改變了樣品的原始形式，不易回收，是以在-endamide藥物殘留分析中，GC已基本被LC取代。
7.2.2 高效液相色譜
HPLC是分析β酰胺中藥物殘留最常用的技術之一，常見的檢測器包括紫外線檢測器（UVD），熒光檢測器（FLD）和二極管陣列檢測器（DAD）。
由于青黴素藥物沒有單一的紫外發射基團，其吸收波長一般為200~235nm，且該波長範圍内的選擇性較小。由于青黴素藥物在生物樣品中的殘留量低，背景幹擾往往較嚴重，是以一般采用柱前或柱後導聯技術，衍生反應可有效提高UVD的靈敏度。如果青黴素是在米喹或 1 ， 2 ， 3 - 曲安奈酮的催化作用下形成的，則最長為 325nm ，在檢測波長處共生成分幹擾測定很少，并且該方法針對β端酰胺環的化合物，利用這一原理， Bioson 、 Verdon 等都建立了檢測青黴素藥物殘留的檢測方法。[0005] 蔡玉軒等人采用HPLC-UVD方法檢測頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素5種頭孢菌素藥物殘留物，以磷酸緩沖液-乙炔為流動相，在270nm處，檢測限小于9.7 sg/kg，回收率為96.5%~105.0%。DAD屬于UVD的一種類型，其原理與UVD相同，可以在全波長下掃描，可用于混合不同波長的物質的檢測。Cmara等人利用DAD建立HPLC檢測羊乳中阿莫西林、青黴素G、青黴素V、阿莫西林、二氯西林、毒死蜱、苯基苯西林、頭孢菌素、頭孢菌素9 β-endamide藥物的殘留物，回收率為79.0%~96.0%。在藥物多殘留分析中，為了達到理想的檢測結果，HPLC可以串聯不同的檢測器，貝尼托-佩納等建立了青黴素G、青黴素V、吡哆醇、苯二氮卓類、毒死蜱、二氯矽烷、阿莫西林8種HPLC-UVD/DAD檢測方法，用于殘留β内酰胺藥物，選擇220nm進行檢測波長，檢測限為8.0~24.0μg/kg， 平均回收率為82.0%~97.0%。
FLD比UVD具有更強的敏感性和特異性，但要求藥物具有熒光特性，這比單一或少數藥物的準确檢測具有一些優勢。由于β内酰胺類藥物沒有熒光發射基團，是以有必要使用衍生物來産生熒光染發基團。羅道等建立了牛奶氨苄西林殘留HPLC-FLD檢測方法，采用甲醛法制得藥物，激發波長和發射波長分别為346nm和420nm，檢測限為1.0μg/kg，回收率為70.0%~110.0%。Terada等人利用氨苄西林可以在甲醛和三氯生溶液中産生熒光衍生物的原理，并利用FLD測定氨苄西林在牛奶中的殘留量。
7.2.3 液相色譜
LC-MS是一種現代分析技術，以LC為分離手段，MS為檢測器。LC-MS結合了LC和MS的優點，将LC對複雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性和靈敏度相結合，特别是串聯質譜（MS/MS）能夠提供更詳細的相對分子品質和結構資訊，使這種組合技術廣泛應用于藥物分析、食品分析和環境分析等諸多領域。
由于ms/MS的研究與開發，LC-MS/MS在β内酰胺類藥物多殘留檢測領域取得了長足的進步。Ohmori等選擇LC-MS/MS檢測了8種β-endamide藥物在血漿中的殘留量，檢出限為0.01~0.5 μg/mL，除多利哌甯外，美羅培南回收率為49.1%、62.3%，其他藥物的回收率均在80.2%以上。馬卡羅夫等人建立了八種青黴素類藥物在牛、豬、雞組織中如阿莫西林、氨苄西林、二氯吡啶、青黴素G、青黴素V、苯二氮卓類、毒死蜱和吡哆醇LC-MS/MS的檢測方法，其内标的法定用量，除阿莫西林回收率僅為50.0%外，其他藥物的回收率均在70.0%以上，所有藥物檢測限值均低于或等于歐盟規定的MRL。Becker等人采用LC-MS/MS方法測定牛奶、阿莫西林、氨苄西林、頭孢菌素、頭孢菌素、頭孢菌素等組織中15種β-裂解酰胺類藥物的殘留，采用ESI-plus檢測，頭孢菌素、青黴素G、青黴素V、苯二氮卓類、鲈魚毒死蜱、二毒死蜱和吡哆醇等，使用ESI檢測，使用基質加成校正基質效應，但氨黃素除外，其回收率僅為57.0%， 其他靶标測定的回收率大于81.0%，所有藥物檢測限值均符合歐盟标準。Lina等人建立了11種Β端酰胺藥物殘留的LC-MS/MS方法，以0.1%醋酸溶液-0.1%甲醇為流動相，30min内分離出18種藥物，平均回收率為71.0%~115.0%，檢出限為0.12~3.94 μg/kg。
Carlier等人采用超高效液相色譜（UPLC）代替HPLC建立了7種β-endamide藥物在血漿中的殘留檢測方法，采用BEHC18（1.7m，100mm×2.1mm）柱分離試驗，含有0.1%的水和乙炔作為流動相，所有藥物在5.5min内檢測完成，大大縮短了試驗時間，所有藥物回收率為86.8%~101.5%。Liu等人建立了檢測牛奶中青黴素G、阿莫西林及多種代謝物（青黴素、青黴素脫唑、青黴素、阿莫西林、阿莫西林、地西泮）的方法，所有藥物均采用ESI plus進行檢測，8min内8種化合物成功分離，藥物的定量限值為2.5~5.0 μg/kg，回收率為85.0%~108.0%， RSD低于13%。Tang等采用UPLC-MS/MS同時測定了牛奶中23種獸藥的殘留，包括7種β酰胺類藥物、12種大環體和4種其他獸藥，檢測限均小于5 μg/mL，回收率分别為51.5%~100.6%、51.8%~139.0%和82.4%~102.5%， RSD分别小于15.0%。UpLC的使用大大提高了色譜分離，加快了藥物分析速度，結合MS/MS檢測儀可以提供詳細的檢測器分子品質和結構資訊，使得UPLC-MS/MS在化學定性和定量檢測中具有獨特的優勢，近年來在藥物分析領域，食品檢測應用發展迅速。
康德尼等人使用液相色譜-線性電離系列質譜法測定動物飼料中的藥物殘留物，如頭孢菌素、頭孢菌素、毒死蜱、二毒死蜱、青黴素G、青黴素V等。Dubala等人建立了一種LC-MS/MS方法，用于同時檢測人血漿中的頭孢子蟲和克拉維克酸殘留物，甲醇-乙炔-2mmol/L乙酸铵溶液（25：25：50，V/V，pH3.5））用于流動相，具有陰離子檢測，分别選擇m/z408（M-（CH3）-2H）和m/z198（M-H）-對于母體離子，SIM測試，2種藥物的化學結構和全掃描見圖5-41， Kantiani等人還研究了該方法的線性度，精度，準确性，離子抑制，基質效應，靈敏度和穩定性。
微生物學
微生物方法又稱微生物抑制試驗，是基于藥物對微生物生理功能和代謝的抑制作用，定性或定量測定樣品中的藥物殘留。常見的微生物方法有紙片法（paperdiskmethod，PD），三苯三苯三苯曲安奈德（TTC）法，圓柱扁法（CP），濁度法，Delvotest-SP法，微生物阻塞法等。
PD将陽性對照紙和裝有待測牛奶樣品的試紙放在接種菌株的瓊脂平盤上，在合适的條件下培養，觀察抗菌環以确定結果。TTC法是一種檢測牛奶藥物殘留的定性方法，最早由Neel和Calbert等人于1955年提出，将牛奶中加入熱成瘾鍊球菌作為培養菌株，根據TTC名額的顔色變化來判斷結果。以旺大舉等藤黃色八球菌為名額，以CP檢測豬、雞組織中氨苄西林殘留物，最低檢出限可達0.00025 μg/mL，比Vilim用熱脂孢子測得的0.0009 sg/mL，标準曲線的工作範圍為0.00125~0.02 μg/mL，變異系數為2.91±0.2%），不同濃度氨苄西林的回收率為83%~107%。李豔華等國标TTC法和AOAC紙法對牛奶中酰胺内藥物殘留的β檢測結果，AOAC紙法能成功檢測青黴素G、氨苄西林、羟嘧啶六種β内酰胺類藥物的殘留MRL濃度，而TTC法不能成功檢測上述藥物的MRL濃度，隻能用于定性檢測。微生物法易受其他抗生素在組織中的影響，特異性低，靈敏度低，但操作友善，樣品劑量大，預處理簡單，适用于大量樣品篩選，常用于牧場、乳品企業等抗生素對牛奶樣品進行大批量篩選檢測。
公元7.2.5年
CE或HIGH毛細管電泳（HPCE）是一種液相分離技術，它使用高壓電場作為驅動力，毛細管作為分離通道，根據樣品組分之間電泳強度和分布行為的差異實作分離。與HPLC相比，HPCE具有色譜柱效率高、選擇性好、樣品量小、樣品分析範圍廣等特點，是近年來分析化學中比較活躍的技術之一。由于β内酰胺類藥物具有有機酸堿基團，是以在毛細血管區域活體遊泳的方法也更為常見。采用HPCE-UV/DAD法檢測環境污水和飼料中10 β種克拉維酸、阿莫西林、氨苄西林、青黴素G、青黴素V、吡哆醇、苯二氮卓類、毒死蜱、二氯矽素和吡拉西林，水樣和飼料中的檢出限分别為0.04~0.06 μg/L和0.80~1.4 μg/L，回收率為82.9%~98.2%，RSD小于9.0%。10種藥物的色譜圖如圖5-42所示。Sérgio等人建立了同時檢測牛奶氨、阿莫西林、青黴素、毒死蜱、四環素、氯黴素6種藥物殘留物、pH8.0 KH2PO4、Na2B4O7溶液中的CE，在18kV電壓下，在210nm處檢測到UVD，并在2.5 sg/mL2和5.0μg/mL的濃度下進行附加回收試驗， 回收率超過72%，RSD低于5%。電滲流不穩定導緻HPCE結果的再現性較差，HPCE的樣品量小，靈敏度低于HPLC，在殘留物分析中的應用受到限制。Bailon等HPCE-UV/DAD方法檢測7種β端酰胺藥物在水中的殘留，可離線選擇SPE純化和濃縮樣品，檢測限為0.08~0.8μg/L，回收率為94%~99%，RSD小于10%。
7.2.6 免疫分析
該方法的優點是操作簡單，檢測速度快，一些生物樣品如尿液可以直接測定，在β酰胺藥物殘留檢測主要用于篩選和分析。免疫分析主要包括ELISA、放射免疫（RIA）等。ELISA是目前應用最廣泛的免疫測定，擁有多種商業化的ELISA酶試劑盒，可用于檢測多種獸藥的殘留，如Bioo USA生産的總抗生素（牛奶）試劑盒，可用于檢測牛奶中的青黴素G、氨苄西林、阿莫西林、苯二氮卓類藥物等β-賴氨酸藥物殘留， 測試限制在4.0微克/千克;組織中的青黴素G，限于0.2μg/ kg。Lamar等人使用用重組蛋白制備的青黴素結合蛋白（PBP）來建立ELISA以檢測牛奶，牛肉，豬肉，蜂蜜，雞蛋中的β酰胺殘留物。
由于青黴素型藥物分子中具有多個抗原決策簇，是以可以在動物免疫中産生多種類型的抗體，是以可以根據待測對象的結構和分析目的引導人工抗原的合成。為了獲得主要鑒定青黴素藥物的抗體，抗原決策簇需要以側鍊抗原決策簇為主，是以在抗原合成中突出側鍊結構，愛德華茲等成功的蛋白質載體交聯到青黴素分子的環基上，得到特異性抗體。另外為了獲得親本特異性抗體，可以鑒定整個青黴素類藥物，合成抗原以突出母體核結構（6-APA）。設拉子類等不同免疫抗原的合成方法，如透醛、青黴素反應，與小鼠免疫應答，得到多種青黴素交叉反應單克隆抗體，利用間接競争ELISA可同時在牛奶和動物産品中氨苄西林、綠色黴素G、羟甲黴素、苯二氮卓類、二氯黴素等β端酰胺藥物殘留，檢測限為2.5~5ng/mL， 并且檢測靈敏度在歐盟MRL範圍内。DeLewu等人直接利用6-APA制備抗青黴素蛋黃抗體，Diertihc等人利用雙德海德的方法制備核特異性抗體，将氨苄西林側鍊氨基與蛋白質連接配接起來，Cliuqet等利用青黴素生理反應合成青黴素蛋白，制備制得核特異性抗體。這些得到的母源特異性抗體與整個青黴素樣藥物具有很好的交叉反應，可用于青黴素樣藥物殘留分析和檢測。
張佳等人建立了對動物組織中β-cylamide型藥物放射性受體殘留物的快速篩選分析，成功用于青黴素G、阿莫西林、氨苄西林、二氯西林、毒死蜱、頭孢菌素等藥物殘留物的檢測，在90min内即可完成，大大加快了測定速度，節省了測定成本。Wei Dong等采用間接競争性ELISA檢測牛奶中阿莫西林殘留，以合成AMX-OVA為檢測抗原，以AMX标準品為競争性半抗原，該方法的最小檢測限為3.926 ng/mL，0.5~2000 ng/mL範圍内樣品添加的平均回收率為91.45%。