引言
帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是全球第二大神經退行性疾病，在65歲以上的中老年人群中患病率約為2%， PD病人典型的病理特征是中腦黑質腦區随衰老而出現多巴胺神經細胞的漸進性退變死亡，且伴有病理性α-synuclein蛋白聚集形成的路易氏小體。絕大多數PD病人屬于散發性PD，也有約10%的PD患者是由于基因突變而緻病。PINK1和Parkin基因的突變可因基因功能缺失導緻早發型常染色體隐性遺遺傳性PD。PINK1為一種蛋白激酶，Parkin是一種E3連接配接酶。基于大量體外實驗的傳統理論認為：PINK1激酶可在Ser65位點磷酸化激活Parkin，二者共同通過線粒體自噬清除受損線粒體，保護神經細胞。雖然目前有超過3300篇PINK1、Parkin研究的相關論文，但并沒有一篇報道在生理狀态下的哺乳動物體内PINK1可磷酸化激活Parkin共同參與線粒體自噬的證據。而且，PINK1/Parkin敲除的小鼠及豬模型均不能模拟PD病人腦中神經細胞退變死亡的重要病理特征，限制了在動物體内對PINK1和PARKIN功能的研究可行性。
考慮到非人靈長類模型與人類更為接近，李曉江團隊曆經六年時間于2019年建立了世界首例PINK1基因打靶猴模型并證明了PINK1缺失在靈長類腦中可導緻神經細胞死亡 （Yang et al., Cell Res 2019）。随後，該團隊的楊偉莉研究員進一步發現PINK1蛋白在生理狀态下的靈長類腦中特異性表達，且通過獨立于線粒體自噬的其它重要激酶功能維持靈長類神經細胞存活（Yang et al., Protein Cell 2022；Chen et al., Zool Res, 2024），提示了同一緻病蛋白在不同物種中的表達和功能具有種屬差異。然而，PINK1的經典底物Parkin在靈長類腦中的功能如何仍不清楚，亟待探究。
2024年10月15日，暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院楊偉莉、李世華及李曉江團隊在Journal of Clinical Investigation線上發表題為Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models的研究論文。該研究利用CRISPR/Cas9技術建立了不同年齡的Parkin缺失猴模型,發現Parkin缺失對猴大腦早期發育中的神經細胞存活無明顯影響，但随年齡增長會造成猴中腦黑質多巴胺神經細胞的明顯變性及死亡、紋狀體部位多巴胺合成減少及病理性pS129-α-syn聚集（圖1和圖2），成功模拟了PD病人腦中的重要病理特征，這與Parkin敲除的小鼠模型及豬模型無法模拟PD病人腦中神經細胞退變死亡的重要病理形成鮮明對比，提示利用非人靈長類動物模型研究Parkin功能的重要性和必要性。
圖1. （A）猴腦注射AAV病毒載體表達CRISPR/Cas9敲除Parkin基因。（B， C）免疫組化染色證明在Parkin基因打靶後猴腦黑質區多巴胺神經細胞（TH）出現明顯退變死亡，且在年老（25歲）猴中的神經細胞死亡更為嚴重。（D）電鏡結果顯示，Parkin敲除可造成猴中腦黑質神經細胞的退變死亡及髓鞘退化。（E）FDOPA PET結果顯示敲低猴腦黑質Parkin可顯著減少紋狀體部位多巴胺的水準。（Credit: Journal of Clinical Investigation）
圖2. Parkin敲除可造成猴中腦黑質出現病理性pS129-α-syn聚集。（A）免疫組化染色顯示Parkin敲除可在猴黑質中造成pS129-α-syn表達增加，且随着衰老這種蛋白聚集更為顯著。（B）高倍鏡圖顯示毒性α-synuclein蛋白形成路易小體。（C）對A圖的聚集體進行統計。（D）在老年（25歲）猴腦黑質神經細胞的胞内及胞外均有病理性pS129-α-syn聚集體形成。（Credit: Journal of Clinical Investigation）
有研究報道Parkin Ser65突變同樣可造成PD發生。大量體外研究發現PINK1可在Ser65位點磷酸化激活Parkin，但由于PINK1蛋白在生理狀态下的小動物腦内及常見細胞系中因表達較低而檢測不到，是以尚無生理狀态下的體内證據證明PINK1介導Parkin的磷酸化。而該團隊前期研究發現PINK1激酶在靈長類腦中特異性豐富表達，在本研究中進一步發現敲除PINK1基因可明顯減少磷酸化Parkin(pS65-Parkin)表達并伴随出現由pS129-α-syn蛋白聚集而成的路易氏小體，該研究首次揭示了在生理狀态下的動物體内PINK1可磷酸化Parkin的證據, 且Parkin 磷酸化的減少與pS129-α-syn蛋白的聚集相關。這為攜帶PINK1及Parkin突變的PD患者在臨床上具有相似的表型提供了新的分子機制。
為了進一步驗證PINK1介導的Parkin磷酸化在猴腦中的重要功能，該研究對野生型Parkin蛋白的Ser65位點進行突變（S65A）使得其不能被PINK1磷酸化。結果發現，過表達野生型PINK1和Parkin均可通過增加Parkin磷酸化水準而減少老年猴腦中病理性α-synuclein蛋白的聚集，進而發揮神經保護作用。而過表達不能被PINK1磷酸化激活的Parkin突變體 (S65A) 則不能有效清除α-synuclein蛋白的毒性作用。此外，該研究也在散發性PD患者腦組織中驗證了在猴腦中的現象，發現散發性PD患者腦中磷酸化Parkin水準表達下調，且在正常衰老的猴腦中可溶性Parkin磷酸化蛋白的表達也出現明顯下調，提示衰老可能是引發磷酸化Parkin功能下調進而介導腦功能異常的一個重要因素（圖3）。綜上，該研究利用靈長類動物模型揭示了PINK1激酶介導的Parkin蛋白磷酸化在衰老和PINK1、Parkin基因突變引發的PD中的重要保護作用，為PD的臨床治療提供了新的潛在靶點。
圖3. 磷酸化Parkin在PD病理中的重要機制模型。衰老、PINK1和Parkin基因突變均可導緻磷酸化Parkin的減少, 進而導緻包括毒性α-synuclein蛋白的累積及神經細胞死亡（Credit: Journal of Clinical Investigation）
值得注意的是，與PINK1缺失猴模型不同，Parkin缺失對猴大腦早期發育中神經細胞功能未見明顯影響，這可能是由于PINK1作為上遊激酶還參與調節其它重要底物。比如，該團隊還利用新鮮野生型猴腦組織進行蔗糖密度梯度離心法分離不同亞細胞器，發現PINK1和Parkin蛋白具有不同的亞細胞定位（Liu et al， Neural Regen Res 2024），也提示PINK1、Parkin蛋白除了通過Parkin磷酸化發揮功能之外，可能還有各自獨立的功能。
參考文獻
1. Chen XS, Han R, Liu YT, Huang W, Wang Q, Xiong X, Zhang Y, Zhao JG, Li SH, Li XJ, Yang WL. Comparative analysis of primate and pig cells reveals primate-specific PINK1 expression and phosphorylation. Zool Res. 2024 Mar 18;45(2):242-252.2. Liu Y, Huang W, Wen J, Xiong X, Xu T, Wang Q, Chen X, Zhao X, Li S, Li X, Yang W. Differential distribution of PINK1 and Parkin in the primate brain implies distinct roles. Neural Regen Res. 2025 Apr 1;20(4):1124-1134.3. Yang W, Liu Y, Tu Z, Xiao C, Yan S, Ma X, Guo X, Chen X, Yin P, Yang Z, Yang S, Jiang T, Li S, Qin C, Li XJ. CRISPR/Cas9-mediated PINK1 deletion leads to neurodegeneration in rhesus monkeys. Cell Res. 2019 Apr;29(4):334-336.4. Yang W, Guo X, Tu Z, Chen X, Han R, Liu Y, Yan S, Wang Q, Wang Z, Zhao X, Zhang Y, Xiong X, Yang H, Yin P, Wan H, Chen X, Guo J, Yan XX, Liao L, Li S, Li XJ. PINK1 kinase dysfunction triggers neurodegeneration in the primate brain without impacting mitochondrial homeostasis. Protein Cell. 2022 Jan;13(1):26-46.5. Han R, Wang Q, Xiong X, Chen XS, Tu ZC, Li B, Zhang F, Chen CY, Pan MT, Xu T, Chen LQ, Wang ZF, Liu YT, He DJ, Guo XY, He F, Wu P, Yin P, Liu YB, Yan XX, Li SH, Li X-J, Yang W. Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models. J Clin Invest. 2024.https://www.jci.org/articles/view/179633
責編|探索君
排版|探索君
文章來源|“BioArt”
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