引言
在當代生物科學研究中，低溫電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技術因其能夠在近原子分辨率下觀察生物大分子的三維結構而被廣泛應用。然而，樣本制備過程中的界面效應常常導緻樣本結構損壞，影響成像品質。傳統的液體電噴霧（Electrospray, ESI）雖然已被應用于樣本制備以減少這些不利影響，但如何優化ESI參數以保持蛋白質的完整性和功能狀态，仍是一個亟待解決的科學問題。4月25日發表于Nature Methods的研究“Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects”，通過優化電噴霧輔助的低溫電子顯微鏡樣本制備技術，來減輕界面效應的影響。研究團隊系統地調整了樣本流速、噴霧電壓、蛋白質濃度等關鍵參數，使用APO-鐵蛋白（apo-ferritin）和血管緊張素轉換酶2（ACE2）作為模型蛋白進行了一系列實驗。該研究發現：适中的樣本流速、較低的噴霧電壓和較高的蛋白質濃度有助于保持蛋白質的結構完整性；使用低導電性的金屬材料在納米電噴霧（nano-ESI）中也顯著優化了蛋白質樣本的結構保持。這些優化措施顯著提高了樣本的成像品質，為使用cryo-EM技術解析高分辨率蛋白質結構提供了有效的方法論支援。該研究結果不僅提高了cryo-EM在蛋白質結構解析中的應用效率和精度，也為了解蛋白質在複雜生物過程中的功能提供了新的視角。這項研究的成功實施，對推動生物醫藥領域的科學研究和技術發展具有重要意義，有助于未來在藥物設計和疾病治療等領域的應用。
Highlights
該研究首次詳細闡述了通過電噴霧輔助的低溫電子顯微鏡（Electrospray-assisted cryo-electron microscopy）技術來優化蛋白質樣本制備的過程。通過調整樣本流速、噴霧電壓和蛋白質濃度，有效地維持了蛋白質的原始結構和功能狀态，這在傳統方法中是難以實作的。
研究團隊進行了系統的參數優化實驗，找出了最佳的樣本流速、噴霧電壓和蛋白質濃度，這些參數的優化對保持蛋白質的結構完整性至關重要。此外，使用低導電性金屬材料在納米電噴霧（nano-ESI）中也顯著改善了樣本的結構儲存。
通過優化的參數設定，研究顯示樣本在低溫電子顯微鏡下的結構完整性得到顯著提高。這為使用cryo-EM技術進行高分辨率蛋白質結構分析提供了強有力的方法學支援。
該技術的成功應用，不僅提高了cryo-EM技術的實用性和效率，還為未來在更多生物大分子結構研究中的廣泛應用打下了基礎。特别是在藥物設計和疾病機理研究等領域，将大有裨益。
Strategies
該研究圍繞優化低溫電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, cryo-EM）樣本制備過程中的電噴霧（Electrospray, ESI）參數，以減少樣本制備時界面效應對蛋白質結構完整性的負面影響。研究通過調節樣本流速、噴霧電壓、蛋白質濃度及噴射距離等參數，探索其對樣本結構保持的影響。利用結構保持良好的蛋白質模型，如APO-鐵蛋白（apo-ferritin）和血管緊張素轉換酶2（ACE2），進行實驗驗證，確定獲得的資料具有普遍性和可重複性。
樣本準備研究使用純化的APO-鐵蛋白和ACE2作為測試蛋白。這些蛋白先通過正常方法純化，然後稀釋到不同濃度，準備用于電噴霧。
電噴霧參數優化樣本流速：研究中測試了從幾微升到幾十微升每分鐘的不同流速，觀察不同流速對蛋白質樣本的影響。噴霧電壓：調節電壓從幾千伏到幾十千伏，分析電壓變化如何影響蛋白質的電荷狀态和結構完整性。蛋白質濃度：蛋白質濃度的變化直接影響樣本在電噴霧過程中的聚集和分散行為。噴射距離：即樣本從電噴嘴到載物玻片的距離，調整此參數以優化樣本着陸前的蒸發和冷卻過程。
結構分析采用低溫電子顯微技術對處理後的樣本進行成像，收集資料，并使用圖像處理軟體如ChimeraX和PHENIX進行三維結構重建和分析。
資料統計與分析對實驗中獲得的大量圖像資料進行統計分析，評估不同參數下樣本的結構完整性比例。使用負染色電鏡（negative staining EM）和native MS對樣本的保持情況進行評價。
通過詳細的參數調整，研究顯示低流速、低電壓和高蛋白質濃度條件下，樣本的結構保持得最好。這些條件有助于減少蛋白質在空氣-液體界面的損傷，進而保持其在冷凍環境下的原始三維結構。此外，低導電性金屬材料的使用在納米電噴霧（nano-ESI）技術中也顯示了顯著的結構保護效果。
Behind the Scenes
低溫電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技術低溫電子顯微鏡（cryo-electron microscopy, 簡稱cryo-EM）技術是一種先進的電子顯微鏡技術，用于觀察生物大分子的近原子分辨率結構。這種技術對生物學研究尤其重要，因為它允許研究人員在接近自然狀态下觀察複雜的生物分子，如蛋白質和病毒。
低溫電子顯微鏡的基本流程樣品制備：首先将生物樣品分散在支援網格上的液滴中。然後迅速冷凍，通常是使用液氮或液氦，使水分子形成玻璃态而不是晶體。這種快速冷凍過程被稱為“急凍”，可以防止冰晶的形成，這對樣品結構的儲存至關重要。電子顯微鏡成像：急凍的樣品在低溫下（通常是液氮溫度，約-196°C）被放入電子顯微鏡中。高能電子束穿透樣品，形成圖像。由于樣品在極低溫度下保持固定，是以可以在幾乎沒有損傷的情況下進行高分辨率成像。圖像處理和三維重建：收內建千上萬個二維投影圖像，通過複雜的算法處理這些圖像以重建出生物大分子的三維結構。這包括使用各種計算方法對圖像進行對齊、分類和平均，以提高信噪比和分辨率。模型建構和驗證：在獲得高分辨率的三維密度圖後，可以在其中拟合原子模型，并進行進一步的分析和驗證，以確定模型的準确性。
技術發展1975年：急凍樣品制備的引入Jacques Dubochet 和同僚們開發了急凍水樣品的方法，這是cryo-EM技術的基礎。這種方法通過快速冷凍樣品來避免冰晶形成，進而在電子顯微鏡下保留了生物樣品的原生狀态。
1984年：第一個急凍電鏡圖像的擷取Alasdair McDowall等人使用急凍技術獲得了首個無冰結構的電鏡圖像，這标志着cryo-EM在生物樣品成像中的一個重要突破。
1990年代：自動資料收集和圖像處理軟體的發展随着計算機技術和圖像處理算法的進步，自動化資料收集和進階圖像重建方法的開發，使得從成千上萬的二維圖像中重建複雜三維結構變得可能。
2012年：直接電子探測器（Direct Electron Detectors）的引入這類探測器的出現顯著提高了圖像的信噪比和時間分辨率，允許研究人員獲得更清晰和更高分辨率的圖像。這一進步極大地推動了cryo-EM技術的應用，使其能夠解析接近原子水準的結構。
2013年和2015年：分辨率革命在這兩年中，多個研究組報道了使用cryo-EM解析達到原子級分辨率的生物大分子結構。這被廣泛認為是cryo-EM領域的一個轉折點，此後，該技術成為了結構生物學中的一個強大工具。
2017年：諾貝爾化學獎Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson因為他們在發展cryo-EM技術，尤其是在高分辨率結構确定方面的貢獻，共同獲得了諾貝爾化學獎。
應用領域低溫電子顯微鏡（cryo-EM）技術的應用非常廣泛，尤其在生物學和醫藥領域，它為了解複雜生物分子的結構和功能提供了強大的工具。主要應用領域包括：
蛋白質結構解析Cryo-EM 在蛋白質結構生物學中的應用非常廣泛，尤其适用于那些難以通過X射線晶體學或核磁共振（NMR）技術解析結構的大分子和複雜體。它可以揭示蛋白質的三維結構，幫助研究人員了解其功能和生物化學性質。
病毒學研究在病毒學領域，cryo-EM 能夠詳細描繪出病毒顆粒的結構，包括其表面蛋白和遺傳物質的排列。這對于研究病毒如何感染宿主細胞以及如何設計有效的疫苗和抗病毒藥物至關重要。
藥物設計通過解析藥物分子與其靶标（如蛋白質或其他生物大分子）的複合物結構，cryo-EM 可以幫助科學家設計更為精确的藥物分子，提高藥物的效力和選擇性。
生物大分子複合物Cryo-EM 特别适合研究多個蛋白質或核酸以及其它分子組成的大型複合物。這些大分子機器往往在細胞中承擔關鍵功能，如核糖體、膜蛋白複合體、分子馬達等。
動态結構分析除了靜态結構外，cryo-EM 還能夠捕捉生物分子在不同功能狀态下的結構變化。這對于了解生物分子如何通過其結構變化來執行生物功能具有重要意義。
納米技術和材料科學雖然主要應用于生物學領域，cryo-EM 也被用于納米技術和材料科學，例如在研究納米顆粒和其他複雜材料的組裝和結構時。
樣本制備過程中的難點在低溫電子顯微鏡（cryo-EM）技術中，樣品制備是一個關鍵步驟，也是挑戰性極大的環節，因為它直接影響到最終圖像的品質和可解析度。樣品制備中常見的難點包括：
樣品濃度和純度樣品必須具有足夠的純度和适當的濃度。雜質和污染物可以幹擾圖像品質，而濃度過高或過低都會影響樣品在支援網格上的分布和最終的資料品質。
急凍技術急凍是cryo-EM的核心，需要迅速将樣品冷凍至液氮溫度以下，以避免冰晶形成。冰晶的存在會幹擾電子束，影響圖像的解析度。實作理想的急凍條件需要精确控制樣品的溫度和冷凍速率。
樣品在支援膜上的均勻分布樣品在支援網格上的分布需要均勻，且厚度适中。不均勻或聚集的樣品會導緻資料收集不一緻，進而影響最終的三維重構品質。
脫水保護在冷凍過程中，水分子在沒有形成冰晶的情況下固化成非晶形的“玻璃态”是理想的。這要求在極短的時間内完成樣品從液态到固态的過渡，任何操作上的瑕疵都可能導緻樣品損壞或結構失真。
電鏡網格的處理和選擇支援網格的品質和處理方式也對樣品制備至關重要。網格需要被恰當地清潔和處理（如膠體膜的塗覆），以確定樣品可以均勻分布且附着力足。
樣品的穩定性和敏感性生物樣品可能對環境條件敏感，包括溫度、pH值和電子束的照射。這要求在樣品制備和電鏡操作過程中嚴格控制實驗條件。
重複性和可靠性確定重複的樣品制備過程中品質的一緻性是一個挑戰，特别是對于具有複雜結構的生物大分子。
技術和經驗要求高品質的樣品制備需要精湛的技術和豐富的經驗。實驗室條件、裝置和操作者的技能都會對樣品制備的結果産生重大影響。
液體電噴霧（Electrospray Ionization, ESI）液體電噴霧（Electrospray Ionization, ESI）技術在低溫電子顯微鏡（cryo-EM）中的應用主要涉及到一種特定的樣品制備方法，稱為電噴霧冷凍（Electrospray Freezing）。這種方法将傳統的電噴霧技術與低溫電子顯微鏡結合起來，以提高樣品制備的效率和樣品的品質。
電噴霧離子化（ESI）最初是一種用于質譜（Mass Spectrometry, MS）的樣品離子化技術。它通過向液體樣品施加高電壓，形成帶電的液滴，然後通過溶劑的蒸發産生帶電的分子或分子團。這個過程使得大分子（如蛋白質、核酸等）能夠在氣相中進行品質分析。
電噴霧冷凍在Cryo-EM中的應用在cryo-EM中，電噴霧技術被用來制備生物樣品。使用電噴霧冷凍的方法，液體樣品在通過一個帶電的噴嘴噴出形成細小的液滴時，可以迅速冷凍。這個過程中，樣品液滴被直接噴射到液氮或其他冷卻劑中，進而瞬間冷凍，形成非晶态的冰，這有助于保持樣品的原生狀态和結構。
優勢快速樣品處理：電噴霧可以迅速生成大量的樣品液滴，适合高通量的樣品制備。最小化樣品量：這種技術可以使用非常少量的樣品進行制備，非常适合珍貴或難以獲得的樣品。減少樣品聚集：通過電噴霧，樣品在冷凍前已經是細小的液滴，這有助于減少樣品在冷凍過程中的聚集現象。
挑戰裝置和操作的複雜性：電噴霧冷凍需要特殊的裝置和精細的操作技術。樣品的穩定性和均一性：確定噴霧生成的液滴大小和樣品濃度的一緻性是一項挑戰。冷凍快速性和效率：必須確定樣品液滴能迅速且有效地冷凍，避免冰晶形成。
電噴霧過程中的荷電水滴傳統研究認為，最終的庫侖破裂（Coulomb fission）事件中生成的荷電水滴将比大分子稍大，并在最後的溶劑蒸發過程中，所有的滴子電荷将轉移到大分子表面。然而，該研究提出在他們的實驗設定中，含有大分子的滴子并沒有完全蒸發成氣相，是以這些分子大部分仍然浸沒在液體中，與氣态離子狀态相比，質子化（protonation）程度較低。
荷電水滴的庫侖破裂與大分子的關系在電噴霧過程中，液體樣本通過噴嘴在高電壓的作用下形成帶電的微小水滴。當這些水滴通過空氣中飛行時，表面電荷積累到一定程度會超過表面張力，導緻庫侖破裂，形成更小的水滴。傳統觀點認為，這些更小的水滴中的溶劑會在接近檢測器的途中蒸發，最終隻留下帶電的大分子。這一過程中，所有滴子電荷被認為會轉移到大分子表面，這對大分子的空間結構可能造成改變，因為電荷重新分布會影響其三維構型。
這一發現對于改進電噴霧質譜技術具有重要意義。通過控制水滴的蒸發程度和質子化水準，可以更精确地保持樣本的原生狀态，進而提高結構分析的準确性和可靠性。此外，這也為解決傳統ESI-MS在處理大分子樣本時可能遇到的問題提供了新的思路，如如何減少樣本處理過程中的結構擾動。
高分辨率結構的保持在ESI過程中，樣品溶液被通過帶電的噴嘴噴出，形成微小的帶電滴子。在飛行至檢測器的過程中，這些滴子會經曆溶劑的蒸發，使得滴子中的溶質（如蛋白質大分子）逐漸濃縮并最終以帶電形式存在。在這一過程中，蛋白質的質子化程度——即蛋白質分子表面質子的數量——将直接影響其三維結構的保持。質子化通常與蛋白質分子的結構穩定性和功能活性有關。質子化過度可能導緻蛋白質分子結構發生變形，進而影響其生物活性。是以，如何在ESI過程中控制質子化程度，以保持蛋白質的原生狀态，是提高分析品質的關鍵。研究中通過控制ESI的各種參數（如噴嘴電壓、流速、滴子的蒸發速度等），實作了對質子化程度的精細調控。特别地，實驗結果表明，在較低的質子化條件下，即使是在極端環境（如高電場和低壓環境）中，大分子如蛋白質也能保持其原生結構的完整性。這為使用ESI技術進行蛋白質和其他大分子的高分辨率結構分析提供了強有力的實驗支援。這一研究不僅優化了ESI技術中的樣品制備和處理過程，也為高分辨率的生物大分子結構分析提供了新的方法論。通過保持大分子的高分辨率原生結構，ESI技術的應用前景将進一步擴充到結構生物學、藥物設計、蛋白質工程等多個領域。
電化學反應模型該研究中提出了一個假設性模型來解釋不同條件下的電化學反應及其對蛋白質結構的影響。研究讨論了電靜力（electrostatic forces）和動能轉化為表面勢能生成的冰層及其厚度梯度，這對于容納不同大小的蛋白質複合體是有利的。在ESI過程中，液體樣本在高電壓的作用下被噴射成帶電的微小滴子。這些滴子在飛行到質譜儀檢測器的過程中會發生快速的溶劑蒸發，導緻滴子内部的溶質（如蛋白質）濃度逐漸增高。在這一過程中，滴子内部的電荷重新分布，并産生強烈的電靜力。這些力量可以導緻蛋白質分子内部或表面的結構發生變化，進而影響其最終的檢測和分析結果。此外，研究中提到的電化學反應模型還考慮了動能到表面勢能的轉化。這種能量轉化能夠在微滴表面形成一層具有特定厚度梯度的冰層。冰層的形成不僅有助于減少蛋白質分子表面的直接暴露于環境中，而且可以提供一個相對穩定的微環境，幫助維持蛋白質複合體的結構完整性。
模型的應用及其對蛋白質結構的影響電化學反應模型提供了一種方法，通過調控電噴霧過程中的電場強度和噴霧參數（如流速、電壓等），以優化冰層的形成和厚度梯度。這種方法特别适用于處理那些結構複雜或容易受到環境影響的大分子，如蛋白質複合體。通過這種模型，可以更精确地控制蛋白質在樣本制備過程中的空間排列和結構穩定性。例如，通過調整電噴霧參數來優化冰層的形成，可以有效地“固定”蛋白質複合體在特定的空間構型中，進而在質譜分析中獲得更為準确和真實的結構資訊。
這種電化學反應模型的應用不僅增強了我們對ESI技術中電荷動态和能量轉化機制的了解，也為蛋白質等大分子的高分辨率結構分析提供了新的技術手段。這對于未來在藥物開發、生物技術以及相關領域中，對蛋白質複合體的結構和功能進行更深入研究具有重要的科學和實際意義。
改善的角度投影覆寫對五種大分子樣本的歐拉角（Euler angle）分布表明，在傅立葉空間（Fourier space）中顯著改善了角度投影覆寫，這對于高分辨率三維重建是至關重要的。
歐拉角分布在低溫電子顯微鏡技術中，歐拉角是描述樣本在三維空間中方向的三個角度——俯仰角（pitch）、偏航角（yaw）和翻滾角（roll）。在進行大分子樣本的三維重建時，不同方向的二維投影圖像将被合成來重建出完整的三維結構。歐拉角的分布決定了這些投影的方向多樣性和全面性，進而直接影響到最終三維結構的分辨率和精确性。
角度投影覆寫的改善在傳統的cryo-EM采樣中，由于樣本在載物玻片上的随機排列和固定，可能導緻某些方向的資料缺失或覆寫不足，稱為方向偏好（preferential orientation）。這種偏好會導緻三維重建中存在盲區，進而降低結構的解析度和可靠性。通過優化電噴霧過程和樣本制備參數，可以顯著改善樣本的角度投影覆寫。具體來說，可以通過調節樣本噴射的速度、角度和溶劑蒸發速度，來控制樣本在載物玻片上的分布和定向。
高分辨率三維重建的科學意義通過改善歐拉角的分布，研究人員能夠擷取更均勻和全面的資料集，這意味着在傅立葉空間（Fourier space）中，各個角度的資料都能得到充分采樣。這種全面的資料采集為重建出無歧義和高精度的三維結構提供了可能，尤其是在解析蛋白質複合體等生物大分子的動态結構和互相作用時，能夠提供更為精确的結構資訊。
通過使用先進的電噴霧技術和優化的cryo-EM樣本制備方法，研究者能夠有效控制樣本的質子化程度和電荷分布，進而影響其在載物玻片上的定向和分布。此外，采用進階的圖像處理算法和資料分析技術，如使用多變量統計分析和機器學習方法來優化角度分布和圖像重建過程，也是實作高分辨率三維結構重建的關鍵。是以，通過改善歐拉角的分布和角度投影覆寫，不僅可以提升cryo-EM技術的結構解析能力，還可以推動對複雜生物分子系統更深入的了解，對于生物醫學研究和相關領域具有重大的科學和應用價值。
潛在的局限性納米電噴霧技術（nano-ESI）的挑戰在實施納米電噴霧輔助的低溫電子顯微鏡（cryo-EM）樣本制備時，研究中指出納米電噴霧（nano-ESI）面臨着由于電化學效應而引起的顆粒分離和潛在的薄液膜蒸發問題。這些問題可能會影響樣本的品質和完整性，進而限制了該技術在某些情況下的應用。
高分辨率三維結構重建的複雜性盡管電噴霧輔助的cryo-EM技術可以改善樣本的處理和三維結構的重建，但從高分辨率的微觀圖像擷取準确資料仍然是一個技術挑戰。特别是在處理超薄樣本時，保持樣本的均勻厚度和避免結構變形需要精确的操作和優化的裝置配置。
适用性和普及性研究中提到，盡管ESI-cryoPrep方法成本較低且維護相對簡單，有望在多個實驗室和研究機構中推廣應用，但其在不同類型蛋白樣本中的普遍适用性和效果仍需進一步驗證。對于如膜蛋白和微小晶體等特殊蛋白樣本的适用性尚未充分探索。
技術參數的優化需求雖然通過調節噴射條件可以優化樣本制備，但精确控制這些參數以适應不同類型的生物大分子仍然是一項挑戰。這包括但不限于溶液注射流速、噴霧電壓、樣本濃度和從噴嘴尖端到網格的着陸距離等，這些都是在實驗中需要精細調控的變量。
長期的實驗驗證和改進研究表明，盡管采用了電噴霧輔助的cryo-EM樣本制備技術帶來了一些初步的成功，但這些方法和技術的長期效果和可靠性還需要通過更多的實驗和資料分析來進一步驗證和改進。
潛在的研究方向優化納米電噴霧（nano-ESI）參數研究顯示，納米電噴霧技術在操作中存在一些挑戰，如電化學效應導緻的顆粒分離和薄液膜的潛在蒸發。未來的研究可以聚焦于如何優化納米電噴霧的操作條件，包括電壓、流速、溶劑的選擇等，以減少這些負面效應。通過精細調控這些參數，可能有助于提高樣品在cryo-EM分析中的結構保持。
擴充到不同類型的生物大分子樣本目前的研究主要集中在幾種模型蛋白上。未來的研究可以将方法應用于更廣泛的生物大分子，如膜蛋白和微小晶體等。這些生物大分子由于其獨特的生物學功能和結構特性，對樣品制備和結構分析的要求更為嚴格。探索适用于這些複雜樣本的電噴霧輔助cryo-EM技術将是一個重要研究方向。
高分辨率三維結構重建技術的進一步發展盡管已有技術能夠支援高分辨率的結構重建，但如何進一步提高分辨率和重建效率仍然是一個重要的研究領域。未來的研究可以探索結合人工智能和機器學習技術，以自動化和優化資料處理流程，提高分辨率和降低資料處理的時間成本。
深入研究電噴霧過程中的微觀實體和化學機制電噴霧過程中涉及複雜的實體和化學變化，對這些過程的深入了解可以幫助科研人員更好地控制實驗條件，優化樣本的制備。未來的研究應當聚焦于電噴霧中液滴形成、電荷配置設定、溶劑蒸發等基本過程的機制研究，以及這些因素如何影響最終cryo-EM圖像的品質和分辨率。
原文連結
Yang Z, Fan J, Wang J, Fan X, Ouyang Z, Wang HW, Zhou X. Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects. Nat Methods. 2024 Apr 25. doi: 10.1038/s41592-024-02247-0. Epub ahead of print. PMID: 38664529.
https://www.nature.com/articles/s41592-024-02247-0
責編|探索君
排版|探索君
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