大約是在10年前，我開始學習乙型肝炎病毒（HBV）的病原學知識。當時，病毒基因組以松弛開鍊環狀的rcDNA，存在于患者血漿中感染性病毒顆粒（Dane 顆粒）的核衣殼内已經成為常識。當我們實驗室以包在核衣殼内的未經或未完成逆轉錄的前基因組RNA（pgRNA）來定義HBV RNA病毒樣顆粒，并确證其的确存在于患者血漿中時，我們是激動的。特别是我，慷慨激昂地想象着：作為嗜肝DNA病毒的HBV有RNA病毒樣顆粒的真實存在，我們或許可以改變教科書中的病毒基因組要麼為DNA、要麼為RNA的描述。下面介紹的這兩篇發表于上世紀（1984年）的文章，讓我冷靜地意識到，我們2016年報導的HBV RNA病毒樣顆粒，充其量不過是對34年前前輩工作的“再發現”，當然我得自我肯定地說，和1984年相比，我們的認識還是有了些小小的螺旋式上升的。
下面介紹下這兩篇文章的主要發現，并以今天的認知事後諸葛亮一下。
這篇題為“Hepatitis B Virus Particles of Plasma and Liver Contain Viral DNA-RNA Hybrid Molecules”的文獻，是來自Stanford大學醫學院Robinson教授實驗室的研究[1]。在此文發表前，該實驗室的Miller (1984年) 已經發現：HBV感染患者肝髒擷取的含HBV DNA分子的微顆粒中分離的核酸，對核糖核酸酶（RNase）處理敏感[2]。在該文的結果圖1中，作者清晰地展示了在瓊脂糖凝膠電泳前用RNase 處理，可使Southern blot放射自顯影因新出現2kb及更小帶型的出現而發生顯著改變，“提示”有RNA在來自患者肝組織的（病毒）顆粒中有RNA的存在。但這HBV DNA/RNA “complex”（注意用詞不是他們後來文章中用的HBV DNA-RNA hybrid molecules）到底是怎樣的一種存在，文章中沒有描述。而我絞盡腦汁試圖用今天的知識去給個答案以顯示“事後諸葛亮”般地聰明的努力，也以失敗告終。
接下來，他們又進一步對分離自微粒的核酸進行分析，以确定其是否存在RNA，或者DNA-RNA 雜合分子（Hybridmolecules）。該研究證明了這些來自患者肝組織及血漿中的病毒顆粒的确含有病毒DNA-RNA雜合分子。并且，病毒顆粒内自帶的DNA 聚合酶活性可将脫氧核苷酸（dNTP）整合到這些DNA-RNA雜交分子的 DNA 鍊中。接下來，在他們這篇晚了四天投稿、但同一天接收連頁碼發表的題為“Hepatitis B Viral DNA-RNA Hybrid Molecules in Particles from Infected Liver Are Converted to Viral DNA Molecules during an Endogenous DNA Polymerase Reaction” [3]的文章中，作者描述了這些病毒顆粒内的HBV DNA-RNA雜合分子在顆粒内自身攜帶的DNA聚合酶的作用下轉換成了病毒DNA。
這應該是早于1996年患者血漿HBV RNA被“首次”報導[4]的有關患者血循環及肝髒内病毒顆粒因為存在HBV RNA殘餘的最早證據。但實話說，我對[3]一文的結果figure 1是持懷疑态度的。按今天的了解，對純化的病毒顆粒體外做顆粒内源的DNA逆轉錄酶促負鍊DNA合成時，作為模闆的pgRNA 大概是每逆轉錄一段被降解一段的（見下示意圖B’虛線所示）。如此一來，32p-dCTP通過摻入标記的要麼是逆轉錄合成的負鍊DNA，要麼是正鍊DNA。不被标記的HBV RNA如何被RNase處理降解的呢？
今天，我們基本了解了，這些血循環中檢測到的HBV pgRNA是核衣殼内的逆轉錄模闆，因逆轉錄不完全而殘餘的pgRNA片段，即未能被p蛋白RNase H一步步降解幹淨，詳細的過程見下圖（修改自[5]）。
pgRNA逆轉錄過程示意圖（修改自ref,其中B’為新添加）
（A）P蛋白與 pgRNA 結合産生包裝信号；（B）P蛋白激活後發生第一次跳轉，跳轉至 pgRNA 3’端 DR1 區域；（B’）在DNA負鍊延伸過程中，P蛋白RNase H結構域同時降解HBV DNA-RNA雜合雙鍊中的pgRNA；（C）負鍊DNA合成完成時，pgRNA 被降解僅保留5’端16-18 nt的RNA引物；（D）RNA引物發生第二次跳轉，跳轉至5’端的DR2區；（E）負鍊合成一段之後發生第三次跳轉，與負鍊3’末端DR1區互補；（F）跳轉完成後繼續開始正鍊合成；（G）在第二次跳轉時若跳轉失敗則在原位合成正鍊 DNA，形成 dslDNA。藍線：pgRNA strand；黑線：新合成的負鍊DNA及3’末端不一緻的正鍊DNA。
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[1] Miller RH, Tran CT, Robinson WS. Hepatitis B virus particles of plasma and liver contain viral DNA-RNA hybrid molecules.Virology. 1984;139(1):53-63. doi:10.1016/0042-6822(84)90329-5.
[2] Miller RH, Robinson WS. Hepatitis B virus DNA forms in nuclear and cytoplasmic fractions of infected human liver. Virology. 1984;137(2):390-399. doi:10.1016/0042-6822(84)90231-9.
[3] Miller RH, Marion PL, Robinson WS. Hepatitis B viral DNA-RNA hybrid molecules in particles from infected liver are converted to viral DNA molecules during an endogenous DNA polymerase reaction. Virology. 1984;139(1):64-72. doi:10.1016/0042-6822(84)90330-1.
[4] Köck J, Theilmann L, Galle P, Schlicht HJ. Hepatitis B virus nucleic acids associated with human peripheral blood mononuclear cells do not originate from replicating virus. Hepatology. 1996 Mar;23(3):405-13. doi: 10.1002/hep.510230303.
[5] Wang J, Huang H, Liu Y, et al. HBV Genome and Life Cycle.Adv Exp Med Biol. 2020;1179:17-37. doi:10.1007/978-981-13-9151-4_2.
來源：片警實驗室