利用工程化質子泵動力蛋白進行電壓成像：質子傳遞途徑的洞見
引言：微生物羅多普信的固有功能通常用光周期來描述：吸收光子開始一個将吸收的能量轉化為一系列機械作用的過程，通常是視黃醛色素的異構化和嵌入蛋白質的随後構象變化，最終導緻離子通過蛋白質的轉運。
在暗态下，全反式RSBH+通常與13-順式異構體存在平衡（BR為50:50），而穩态照射導緻均一的全反式種群。在基态下，BR顯示出最大吸收波長（λmax）約為570 nm。吸收光子後，RSBH+進入Franck-Condon S1态（H），衰減為激發态中間體I460，然後通過自發輻射和非輻射弛豫而回到基态S0，也可以從I460進入具有光異構化特征的反應态。
光吸收将視黃醛從基态S0帶入Franck-Condon态。從激發态S1，可以通過多光子過程達到更高的激發态Sn。經過幾百飛秒，一部分分子将通過非反應性熒光發射回到基态，其他分子将通過光周期進行，導緻質子轉位。
L到M1：質子從RSBH+轉移到Asp85；M1到M2：質子從涉及Glu194和Glu204的質子釋放複合物釋放；M2到N：Asp96再質子化RSB；N到O：Asp96從胞漿媒體再質子化；O到bR：質子從Asp85轉移到質子釋放群。
視黃醛色素通過Lys216與螺旋連接配接。在RSB和質子受體Asp85之間發現了三個水分子（water402為藍色，water401和water406）。
BR中質子釋放區域的結構。多個側鍊和水分子參與質子釋放過程。關鍵殘基Glu194、Glu204和Arg82在此處示意。
BR中質子攝取區域的結構。在光周期中，多個殘基，包括Asp36、Asp38、Asp102、Asp104和Glu166，可能參與質子給體Asp96的再質子化過程。
微生物類視黃醇酮在其暗态下由于RSB的自發輻射而具有微弱的熒光。經過光激發和從Franck-Condon态的弛豫後，RSB可以進入非反應性的S1态，發射一個光子回到基态S0，進而實作松弛。
熒光的量子産率（QY）很低（對于BR而言約為10^(-4)到10^(-5)），因為RSB被優化為促進光化學反應循環，進而導緻光異構化的高QY（對于BR而言為0.64）。
這與約為0.5皮秒的短壽命的激發态一緻。BR的早期實驗顯示了近紅外熒光，在600到900納米範圍内，最大值約為740納米，并且對pH值具有較強的依賴性。其發射帶包括光中間體熒光态的貢獻，除了自發輻射（BR568）。
來自于O中間體和另一個高熒光中間體“Q”，它們是由連續吸收2或3個光子産生的。O和Q具有不同的衰減動力學，并且它們對熒光的相對貢獻被顯示與激發功率和pH值有關。
紅移的O中間體具有全反構的色素和質子化的對離子特征。O的熒光發射被發現與pH值有關，随着pH值的增加，熒光壽命和量子産率降低。Q中間體是在非熒光N中間體的光激發下形成的，該中間體在堿性條件下穩定。Q的量子産率比BR568高約100倍。
具有類似O的紅移吸收，其熒光壽命對pH值相對不敏感。pH值改變了N（分支到Q）和O态之間的平衡，進而影響了發出的熒光。Q的異構化狀态很可能是全反構的，因由13-順式N态的光激發形成的。N的前熒光積累也可以在從M到N的過渡中受到影響，都位于13-順式構象空間内。
在Arch3被應用為GEVI後不久，對其電壓敏感機制的研究就開始進行了。Arch3的熒光也被認為是由光中間體産生的，使用泵浦-探測光譜學，發現Arch3的熒光來自一個三光子過程：第一個光子初始化光周期，第二個藍移光子被N态吸收，使光周期分支到Q，第三個光子從Q态激發熒光。
在HEK293細胞中表達的Arch3顯示出由膜電位調控的快速熒光變化。為了消除在标準神經成像照明下測量到的光電流（10 pA，I = 1800 W/cm^2），将Arch3的質子供體D95突變為無電荷的Asn，類似于對BR的研究。結果産生的突變體Arch3(D95N)沒有光電流，在較低的RSB pKa下，顯示出更高的敏感性。
結論：單個突變通常被建立以積極影響GEVI蛋白的一種新出現的特性（亮度，靈敏度，響應動力學，光電流），但通常也會影響GEVI功能的其他方面。反離子通常是封閉質子轉移通路并消除光電流的第一個工程位點；僅突變反離子通常會以犧牲電壓敏感性或響應動力學為代價。
