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引言
許多古細菌譜系栖息在海洋表層沉積物中，盡管它們的分布、代謝能力和種間互相作用在科學研究領域仍然處于相對空白的狀态。
我們從CR邊緣恢複了古細菌的宏基因組組裝基因組(MAGs)，并将它們與來自較淺環境的近親進行了比較。
本次實驗研究了6個不同古細菌譜系(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)的31個mag，并對Lokiarchaeota和Bathyarchaeota門的代表性mag進行了全面分析。
我們将基因組學和熱力學模型結合起來，強調了不同古細菌譜系之間共生互相作用的生态和生理條件，并利用系統發育推斷來解釋CR深層沉積物中深海古生菌非典型共生作用的發展。
如果Lokiarchaeota與使用硝酸鹽、亞硝酸鹽和亞硫酸鹽作為電子受體的生物體結合，那麼Lokiarchaeota降解苯甲酸鹽在遺傳上是可能的。
這些代謝特征表明，這個深海古菌譜系可能是産甲烷和産丙酮的深海古菌譜系之間的過渡。
一、深海沉積物中的古細菌分布、生态作用和适應政策研究進展
海洋地下沉積物富含不同的古細菌譜系，盡管它們的分布、生态作用和适應政策尚未得到充分研究。
宏基因組測序和單細胞基因組學使新生物體的發現、新代謝的闡明、已知譜系的擴充和基因樹部分的重新定義成為可能。
深海海底分解的基因組仍然很少，這意味着深海生物圈中特定生态位的适應尚未得到很好的了解。
阿斯加德古菌的基因組分析表明，其真核同源物豐度很高，并表明其代謝功能多種多樣。
從主要依賴于通過Wood-Ljungdahl途徑和丙酮生成的碳固定的自養生活方式，到使用甲基com還原酶樣酶消耗蛋白質和脂肪烴的異有機營養生活方式。
深海archaeota是另一種古細菌門的成員，其特點是具有廣泛的代謝範圍，能夠異養清除蛋白質、碳水化合物、短鍊脂質和其他作為底物的還原化合物，以及它們的甲烷代謝潛力。
深海古生物基因組也表明了碳固定和丙酮生成的潛力，深海archaeota的甲烷生成和丙酮生成途徑的進化路徑仍未得到解決。
我們詳細研究了從CR邊緣的宏基因組中恢複的古細菌基因組，并将它們與從較淺地點恢複的近親進行了比較。
本次實驗研究了31個古細菌宏基因組組裝基因組(MAGs)，它們屬于6個不同的古細菌譜系(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)。
我們對Lokiarchaeota和Bathyarchaeota兩個新的古細菌譜系進行了代表性的MAGs分析，分析表明，Lokiarchaeota基因組編碼厭氧處理和降解脂肪烴和芳烴的基因。
二、DNA提取和測序以及宏基因組組裝的基因組分類
使用IQ-Tree基于16種核糖體蛋白(L2、L3、L4、L5、L6、L14、L15、L16、L18、L22、L24、S3、S8、S10、S17和S19)的串聯計算出最大基因樹。
基于最佳拟合替代模型(VT + F + R10) 計算進化距離，并使用1000個超快速自舉和近似貝葉斯計算對單個分支位置進行測試。
使用HMMsearch工具對代表特定代謝途徑關鍵基因的定制HMM資料庫篩選來自所有MAGs的預測蛋白。
通過使用BlastKoal在KEGG資料庫中查詢預測蛋白來評估通路的完成度，鑒定碳水化合物活性酶，進行細胞定位鑒定。
使用USEARCH-ublast對MEROPS資料庫進行蛋白酶、肽酶和肽酶抑制劑的鑒定，轉運蛋白鑒定，檢測每個bin中預測蛋白的系統發育分布。
使用相應的KEGG條目作為搜尋關鍵字，手動整理對齊的序列,計算系統發育樹，并使用最優拟合模型描述進化關系。
對CR Lokiarchaeota及其潛在夥伴中提出的氧化還原反應進行初始吉布斯自由能(ΔrG’)計算，使用平衡器，應用pH為8，每種反應物濃度為1mm。
通過計算CR位點U1378和U1379近原位條件下五個氧化還原反應的吉布斯自由能，進一步證明了為新的CR Lokiarchaeota基因組提出的耦合氧化還原反應是否可行。
吉布斯自由能的計算公式為:
在這項研究中，ΔG0r使用每種物質的标準吉布斯生成自由能熱力學資料計算，并使用R包CHNOSZ修正為接近原位壓力和溫度(4°C)。
Qr為反應商，可通過關系式計算
三、基于16S rRNA基因分析的優勢古細菌譜系多樣性
在CR邊緣的5個深度的沉積物樣本中，古細菌的豐度很高。
從這些樣本中收集宏基因組資料并檢查小亞基核糖體基因,從宏基因組中共恢複了126條16S rRNA基因序列。
與古細菌相關的序列(31個序列占總數的25%)代表了廣泛的譜系多樣性，包括深海archaeota、熱原體和Lokiarchaeota。
在分析的5個深度中，回收了31種不同的古菌mag草圖，僅對11種完整性高、污染低(完整性高于60%、污染低于5%)的mag進行了基因組分析。
通過将他們預測的蛋白質與NCBI (nr)資料庫進行比較，進一步評估基因組品質，以評估分類基因組内系統發育一緻性的程度。
每個MAG中大多數預測蛋白的分類歸屬(60-75%)與各自的系統發育類群一緻，但CR_12中隻有15%的編碼蛋白屬于Heimdallarchaeota，被排除在進一步的分析之外。
使用16種核糖體蛋白确定草圖基因組的系統發育位置，實驗發現的MAGs隸屬于6個不同的系統發育譜系，即Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea。
所有從CR沉積物中回收的古細菌MAGs都含有真核特征蛋白(ESPs)，這些esp包括專門用于資訊處理、運輸機制、泛素系統、細胞分裂和細胞骨架形成的蛋白同源物。
從CR中恢複的阿斯加德古菌基因組，例如Heimdallarchaeota和Lokiarchaeota MAGs (CR_06, CR_11)，顯示出大量真核同源物，并覆寫了廣泛的ESPs類别。
在CR中回收的深海archaeota, Hadesarchaeota和Thermoplasmata MAGs中也檢測到esp，隻有阿斯加德基因組具有細胞分裂和細胞骨架的同源物。
MCR複合物基因(mcrABCDG)在微基因組和整個宏基因組中均不存在，說明CR沉積物中的短鍊烷烴未被MCR複合物氧化。
使用定制的HMM搜尋，篩選所有宏基因組讀數和mag，以尋找可能的替代碳氫化合物降解途徑，這些搜尋專門針對脂肪族和芳香族碳氫化合物降解途徑的關鍵代謝基因。
成功發現了多種途徑，包括甘酰基自由基酶相關基因與正烷琥珀酸合成酶(AssA)和苄基琥珀酸合成酶(BssA)偶聯，通過在正烷和單芳香族化合物與富馬酸鹽之間形成C-C鍵形成碳氫化合物加合物，分别激活正烷和單芳香族化合物。
由于Lokiarchaeota CR_06的污染水準最低，從Lokiarchaeota CR_06中恢複的BCR亞基B的系統發育分析表明，它們隸屬于Bzd綱，由4個亞基(BzdONPQ)組成。
這種BCR類型最初是在β變形杆菌屬、偶氮古菌屬埃萬西i中發現的，在CR_06中檢測到的BCR與在不同的β、δ變形杆菌屬和其他古細菌譜系(如Lokiarchaeota、Bathyarchaeota和Archaeoglobus)中檢測到的BCR密切相關。
亞基P和Q具有ATP結合/ATP酶功能域，并通過[4Fe-4S]簇連接配接在一起。
還原後的鐵還毒素将電子轉移到輔酶a酯結合域(O和N亞基)，催化苯甲酰輔酶a芳環的裂解，生成二烯基輔酶a産物。
在CR_06中，BCR複合體的4個亞基位于一個連續的操縱子(CR_06-contig-100_3495)上，但由于基因組的高度碎片化，沒有在相鄰的基因組鄰域中發現可靠的系統發育标記基因。
對于CR_06 MAG的高片段化水準(支架數= 1110)，盡管基因組表現出> 200x的高覆寫水準，一個合理的解釋是，存在高水準的系内菌株異質性。
CR_ Lokiarchaeota (CR_06)和其他位于CR邊緣的Asgard古菌可能以芳烴為食異養生長
Asgard MAGs基因組内容中編碼不同類型細胞色素氧化酶和厭氧呼吸的基因的缺失(CR_06, 07, 08, 11和12)表明它們無法将這些碳氫化合物完全礦化為CO2和H2O，這将允許高能量産量。
它們為介導這些有機大分子發酵成醋酸酯和其他還原産物的基因編碼，在正ΔrG '值(ΔrG ' = 196.3 [kJ/mol])的CR條件下，這在熱力學上是不利的，因為這意味着這些基因是選擇性維持的。
由于基因組不完整(86%完整)，我們不能排除存在完整的芳香烴礦化途徑的可能性，使用一種或多種氧化底物作為電子吸收。
更有可能的情況是，Lokiarchaetoa通過與能夠氧化生物降解中間體的夥伴的共生互相作用獲得能量。
通過比較所有可能的代謝和熱力學情景來推斷海洋地下條件下潛在的共生夥伴的身份，并根據宏基因組資料集中代謝途徑的存在和每種條件下的熱力學可行性來衡量每種情景。
我們計算了各種底物濃度條件下偶聯反應的吉布斯自由能，最佳條件表明，苯甲酸酯(芳香烴降解途徑中的中心代謝中間體)的降解可能發生在以下代謝條件下:
(a)苯甲酸酯礦化為CO2和H2O，亞硝酸鹽還原為氨(ΔrG ' =−1206.3 [kJ/mol]);
(b)苯甲酸鹽礦化生成CO2和H2O，亞硫酸鹽還原生成硫化氫(ΔrG ' =−373.6 [kJ/mol]);
(c)苯甲酸酯礦化為CO2和H2O，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽(ΔrG ' = - 119.9 [kJ/mol])。
交換底物的類型和複雜性是影響Lokiarchaeota同養關系和同養夥伴身份的另一個關鍵因素。
編碼膜結合電子分叉類[NiFe]氫化酶的基因3b和3d組的存在，它們将NADH+和NADPH+的氧化與H2的進化結合在一起，也表明Asgard和它們的夥伴之間存在氫的協同交換。
在共生夥伴之間有效的底物和電子交換需要生物導管(如IV型毛或鞭毛)或某種允許細胞外電子轉移的電子穿梭體(如多血紅素細胞色素)的存在，我們篩選了CR_06的這些機制，并确定了種間底物和電子交換的兩個候選機制。
代謝分析表明，CR_14含有編碼不完全甲基營養産甲烷途徑的基因，但缺少編碼MCR複合物(mcrABCDG)的關鍵基因。
CR_14顯示出利用第4組氫化酶(甲酸氫解酶)将甲酸作為電子和氫供體的潛在能力，這些電子通過三甲胺氧化物還原酶或厭氧二甲基亞砜還原酶(TMAO/DMSO還原酶)将三甲胺n -氧化物(TMAO)還原為三甲胺。
編碼三甲胺特異性corcoroid蛋白的基因以及多種甲基轉移酶CoB - CoM異二硫還原酶/F420非還原性氫化酶(hdrABCD和mvhADG)的存在表明，CR_14有能力回收輔酶M (CoM)和輔酶B (CoB)，并将甲基從三甲胺轉移到CoM- sh。
我們找到了編碼四氫甲烷蝶呤s -甲基轉移酶(mtrA- h)的基因，表明mtrA蛋白将甲基從CoM轉移到5,6,7,8-四氫甲烷蝶呤(H4MPT)，并通過CODH/ACS複合物的β亞基将甲基吸收成乙酰輔酶a，取代了Wood-Ljungdahl途徑甲基分支的功能。
CR_14是唯一具有從單甲基化、二甲基化、三甲基化化合物中轉移甲基的深海古菌MAG。
深海archaeota CR_14的這些集體代謝特征表明，該基因組可能代表了一個譜系，通過采用非典型的産甲烷生活方式，在産甲烷和産醋酸的深海archaeota之間建立了橋梁。
乙酰輔酶a合成酶β亞基(AcsB)的系統發育樹顯示，CR_14 AcsB基因與從其他深海古菌系、Asgard門、Chloroflexi和Altiarchaeales中恢複的基因聚集在一起。
該分支的獨特性源于先前的假設，即Altiarchaeales成員擁有一個古老版本的AcsB。
Chloroflexi的成員編碼了這種古細菌版本的ACSβ亞基，類似于深海archaeota、Asgard門和Altiarchaeales中的ACSβ亞基。
這種ACS類型支援阿斯加德古菌依賴氫的自養生活方式，我們假設深海archaeota具有ACS類型，能夠利用不同的載體蛋白(CoM, H4MPT，以及可能是其他未知的載體蛋白)将甲基結合到乙酰輔酶a中，使深海archaeota能夠吸收來自各種甲基化化合物的甲基。
所有CR古菌MAGs都富含ESP編碼基因，這些真核生物同源物的廣泛分布表明，ESPs在厭氧古細菌中比以前認識到的更為普遍。
實驗中使用的沉積物是從更深的深度收集的，是以分析重點是屬于深海archaeota和Lokiarchaeota的mag，以了解它們在深海沉積物條件下的生态潛力。
深海沉積物富含脂肪族和芳烴，為相關微生物提供了相當一部分的能量和碳需求。
碳氫化合物的降解僅限于有限的細菌和古細菌門(如Aminicenantes, TA06, Aerophobetes, Atribacteria, Helarchaeota和Bathyarchaeota)。
考慮到在海底沉積物能量有限的條件下芳烴分解的高能量需求，當CR_Asgard/CR_Lokiarchaeota具有發酵和/或産丙酮的生活方式時，在它們的基因組中發現atp依賴的BCR複合物(Bzd類)令人感到意外。
Lokiarchaeota的潛在夥伴屬于不同的代謝組(例如硝酸鹽還原劑、亞硝酸鹽還原劑、硫酸鹽還原劑、亞硫酸鹽還原劑和硫代硫酸鹽還原劑)，但在地下條件下，隻有亞硫酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽還原劑在熱力學上更受青睐。
總結
本次實驗中，我們采用了基于宏基因組學的基因組學方法，從5個不同樣品的宏基因組資料集中成功恢複了31個mag，分别屬于古菌門(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)。
隻有11個mag符合我們的完成和污染門檻值(>60%完成和<10%污染)，并被納入詳細的基因組分析和代謝重建。
超過90%的高品質基因組隸屬于深海archaeota和Asgard門，每個MAG中預測的蛋白質的系統發育關系證明了本研究中考慮的MAG的适當品質。
在相同的環境條件下，不同種類的同養生物可能需要共享不同品質的底物(例如，醋酸酯、丙酸酯和其他短鍊脂肪酸)。
這表明除了先前提出的氫營養夥伴外，還存在能夠醋酸氧化和短鍊脂肪酸氧化的Lokiarchaeota共養夥伴。
我們假設熱力學優勢和共享代謝物的潛在多樣性将推動Lokiarchaeota進行合胞，而不僅僅是個體代謝物交換。
深海archaeota已被證明具有産甲烷和産丙酮的能力，一般來說，與傳統産甲烷菌相比，深海古生菌譜系廣泛分布于不同的海洋底栖生物栖息地，這可能得益于它們在熱力學有利條件下降解多種有機化合物的産丙酮能力。
CR沉積物中氧化底物的氧化還原電位和可用性可能不利于完全産甲烷和相關産甲烷古菌的發生。
實驗從深層地下沉積物收集到的樣本中發現了古細菌mag，其中一些品質高，完整性好。
許多CR古細菌MAGs，特别是那些屬于阿斯加德宿主真核生物特征的，能夠降解脂肪和芳香烴，并與代謝多樣化的共生生物建立了假定的夥伴關系。
這些環境條件包括深海環境中存在高水準的甲基化化合物(例如甲基化胺)，以及缺乏回收這些甲基化化合物并将提取的甲基直接運送到Wood-Ljungdahl途徑所需的專用途徑。
在這些CR沉積物中，不同的環境條件可能捕獲了産丙酮和産甲烷生活方式之間的中間過渡。
參考文獻
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