前言：
動物視紫紅質是一種光敏G蛋白偶聯受體，通過吸收光子的11-順式視黃醛色素分子連接配接到蛋白質部分上。它們有七個跨膜α螺旋結構，作為光敏感器參與各種生理事件，如視覺和生物節律的調節。在吸收光線後，11-順式視黃醛發生光異構化，動物視紫紅質也會經曆一系列構象變化形成信号傳導能力的Meta-II中間态，并激活G蛋白。
一、研究背景和意義
視黃醛舍甫堿的質子化狀态是決定視紫紅質吸收光譜的重要因素。未質子化的舍甫堿在紫外區吸收光，而質子化的舍甫堿則在整個可見光譜範圍内吸收。質子化的舍甫堿通過無能壘的S1激發态勢能面實作了快速的“順式-反式”異構化。
質子化舍甫堿的質子通過與氨基酸殘基的負電荷穩定，其中在脊椎動物視紫紅質中已确定為位于跨膜3（TM3）上的Glu113。Glu113位于舍甫堿附近，可能形成直接的鹽橋，這與FTIR結果一緻。
相比之下，在無脊椎動物視紫紅質中，對離子位于連接配接TM4和TM5的第二細胞外環（ECL2）中的Glu181。這意味着在脊椎動物視紫紅質的進化過程中，對離子從Glu181轉變為Glu113。
在脊椎動物的視紫紅質中，氨基酸殘基Glu113是高度保守的，而Glu181存在于包括脊椎動物在内的所有動物視紫紅質中（除了某些錐狀視蛋白）。這表明Glu181可能是祖先視紫紅質中原始的對離子，但其結構尚未被可視化。
烏賊視紫紅質（SquRh）和跳蛛視紫紅質1（SpiRh1）的結構顯示，Glu181與舍甫堿之間的距離約為6 Å。是以，目前仍在進行實驗和理論研究，以闡明Glu181作為對離子的分子機制。
從Glu181到Glu113的位移會影響G蛋白的激活效率（[13]）。這樣的位移可以導緻高效的G蛋白激活，進而增加了脊椎動物視紫紅質相對于無脊椎動物視紫紅質的光敏度。
- 研究方法
研究發現，脊椎動物視紫紅質和無脊椎動物視紫紅質之間的差異在于胞質側TM6的較大開放運動（相對于無脊椎動物視紫紅質），這導緻了單穩态和雙穩态視紫紅質之間的G蛋白活性差異（[18]）。
最近的研究發現了一種名為JelRh的水母視紫紅質，它使用Glu94作為對離子，能夠觸發Gs蛋白介導的光傳導級聯。JelRh具有前景的光遺傳學應用潛力，但其光反應特性和激活機制仍需進一步研究。
使用低溫紫外-可見和傅立葉變換紅外光譜測量方法對JelRh進行了研究，了解其視黃醛結合口袋的結構。主要關注分析視黃醛光異構化過程中形成的初始中間體Batho的結構，并将其與脊椎動物和無脊椎動物視紫紅質進行比較。
對離子位移至TM2引起的視黃醛結構、異構化過程和蛋白質互相作用的相似性和差異。選擇牛視紫紅質（BovRh）代表脊椎動物視紫紅質，烏賊視紫紅質（SquRh）代表無脊椎動物視紫紅質，并分析從11-順式到全-反式和類異構的9-順式過程。
二、JelRh視蛋白的晶體結構描述
在77K下，JelRh的紫外-可見吸收光譜顯示最大吸收波長為500 nm，與之前的實驗結果一緻。使用500 nm的光照射産生了Batho中間體，波長為514 nm。使用大于610 nm的光照射後恢複到靜息态，類似于BovRh和SquRh的光變色性。
使用大于520 nm的光照射産生了9-順式結合形式，波長為493 nm。通過差異光譜和複位光反應觀察到JelRh的光反應特性與BovRh和SquRh相似。傅立葉變換紅外光譜可以确定不同視黃醛異構體的光變色特性。
為了了解JelRh的結構和異構化過程，研究人員在77K下使用光照條件進行了差異傅立葉變換紅外光譜測量，以擷取有關JelRh視黃醛及其結合口袋的結構資訊和更詳細的異構化過程資訊。
負峰對應于JelRh或Iso-JelRh的振動，而正峰對應于Batho态。在1555 cm-1和1518 cm-1處的C=C伸縮振動被認為分别對應于JelRh的靜息态和光照照射下的Batho态。
指紋區域的峰主要由C-C伸縮振動和C-C-H彎曲耦合引起，對視黃醛的異構态非常敏感。JelRh的Batho/JelRh光譜形狀在1200 cm-1左右與Batho/BovRh非常相似，但與Batho/SquRh不同。JelRh中的一些峰帶與BovRh中的相應峰帶非常相似，這表明JelRh中的11-順式到全-反式視黃醛的異構化過程與BovRh類似。
在BovRh中，先前的研究确定了C=NH和C=ND伸展振動的頻率分别為1656 cm-1和1623 cm-1，內插補點為33 cm-1。在BovRh的Batho态形成時，這些振動在1654 cm-1和1626 cm-1處觀察到，內插補點為28 cm-1。這表明靜息态和Batho态的質子化席夫堿氫鍵強度幾乎相同。
三、視黃醛異構化過程的分析
在靜息态和Batho态之間的FTIR差異光譜中，準确觀察席夫堿的振動帶是困難的。此外，α-螺旋主鍊的C=O伸縮振動（酰胺-I帶）和JelRh、SquRh中的C=NH伸縮振動也會在相同的頻率區域重疊。
無法從中推導出席夫堿的氫鍵強度。值得注意的是，在D2O中席夫堿的N-D伸展振動可以直接提供關于席夫堿氫鍵的資訊。
BovRh的研究通過X射線晶體學、NMR和光譜分析顯示，與Batho中間體形成相關的蛋白質部分的構象變化僅限于視黃醛結合口袋周圍的局部區域。在三種錐體視蛋白中觀察到了酰胺-I帶的差異，這被認為是由于視黃醛結合口袋的結構和/或視黃醛-蛋白質互相作用的差異。
通過觀察酰胺-I帶的變化作為探針，可以驗證視黃醛結合口袋的局部結構差異。在圖5a中，JelRh的酰胺-I帶被觀察為1664 (-)/1658 (+) cm-1，與BovRh (1662 (-)/1657 (+) cm-1)和SquRh (1658 (-)/1654 (+) cm-1)相似。這個頻率特征與αII螺旋相似，這也是動物視蛋白的錐體視蛋白共有的特征。
需要注意的是，在JelRh和SquRh中，酰胺-I振動在<1650 cm-1處的光譜變化比BovRh小很多。這表明在視黃醛異構化過程中，JelRh和SquRh中肽鍊的局部結構變化非常小。
羧酸的氫鍵變化和質子化反應可以通過觀察>1700 cm-1區域的質子化羧酸C=O伸展振動來監測。在BovRh中，位于1773 (+)/1766 (-) cm-1和1739 (-)/1735 (+)/1727 (-) cm-1處的成對帶被歸因于TM2中Asp83和TM3中Glu122的C=O伸展振動。這兩個羧酸被認為在細胞外視黃醛結合口袋和胞内G蛋白互相作用位點之間組織了重要的氫鍵網絡。
在JelRh和SquRh中，沒有觀察到源自質子化羧酸氫鍵變化的1800-1700 cm-1區域的帶子。盡管JelRh和SquRh保留了位于位置83處的Asp殘基，但122位置的Glu被Gln和Phe所取代，是以未觀察到Glu122帶子。
關于在JelRh和SquRh中觀察不到Asp83氫鍵變化的原因，可能是在與Batho狀态形成相關的早期光反應步驟中，位置83附近沒有發生構象變化，或者Asp83在此過程中失去了質子化。
四、視黃醛結合口袋構象的變化
通過觀察組成視黃醛結合口袋的氨基酸側鍊發生的變化，也可以揭示反離子位移的影響。在BovRh和Iso-BovRh中，觀察到3487 (+)/3464 (-) cm-1 和3489 (+)/3480 (-) cm-1 的一對帶子，歸因于Thr118的O-H伸縮振動。
這是一個D2O不可交換的帶子。在負的3464 cm-1和3480 cm-1處觀察到了16 cm-1的頻移，表明Thr118的氫鍵強度在BovRh和Iso-BovRh之間存在差異。實際上，Thr118的OH基團與Gly114的骨架羰基氧原子形成氫鍵，它們之間的距離分别為2.8 Å（11-cis結合形式）和2.9 Å（9-cis結合形式），表明氫鍵強度有所不同。
在SquRh中沒有觀察到明顯的帶子，而SquRh中的118位氨基酸被Gly所取代，這與O-H伸縮振動帶子在相應頻率區域缺失一緻。由于JelRh在118位上具有與BovRh相似的蘇氨酸，這些配對的帶子可以歸因于Thr118的O-H伸縮振動帶子。
Thr118的氫鍵夥伴可能是Gly114的主鍊C=O氧原子，就像在BovRh中一樣。與BovRh相比，JelRh中的Thr118的O-H伸縮振動頻率較高，這表明Gly114和Thr118之間的氫鍵強度較弱，即Gly114的主鍊氧原子與Thr118的側鍊氫原子之間的距離較長。
與BovRh相比，JelRh顯示出11-cis和9-cis形式的源自Thr118的O-H伸縮振動帶子具有相同的頻率。這意味着視黃醛異構體的化學差異不會影響Gly114和Thr118之間的互相作用。
五、對JelRh視蛋白的研究結果總結
在JelRh中，位置118可能與視黃醛的C9發生互相作用，而這導緻了視黃醛多烯鍊和Thr118之間的空間距離更長，表明多烯鍊周圍的空間更大。這個結果與JelRh的酰胺-I帶和HOOP振動的強度較BovRh小的觀察結果相一緻。
JelRh中Thr118的O-H伸縮振動帶是D2O不可交換的，與BovRh類似，這表明環繞Thr118的蛋白質環境是非常疏水的。
在BovRh中，内部水分子在視黃醛結合口袋中扮演重要角色。它們穩定了質子化的席夫堿和反離子之間的鹽橋，并形成了與關鍵氨基酸（Asp83和Glu122）的氫鍵網絡。
晶體結構還顯示，SquRh和/或SpiRh1中存在一條水分子鍊通過Asp83延伸，填充了視黃醛和Asn302之間的螺旋間腔，這對于G蛋白活性至關重要。這表明水分子在連接配接視黃醛結合位點的構象變化與與G蛋白互相作用的細胞質側之間起到了橋梁作用。
通過FTIR光譜檢測到BovRh和SquRh晶體中的水分子的O-D伸縮振動，這與晶體結構中觀察到的蛋白質結合水分子一緻。與BovRh相比，SquRh中與視黃醛色團相鄰的區域存在更多的水分子，這可以通過水分子的O-D伸縮振動差異來觀察到。
BovRh在負側和正側分别顯示6個振動，而SquRh分别顯示8個和9個振動，與晶體結構中僅在SquRh中觀察到的通過Asp83的水分子鍊的觀察結果一緻。
六、結論
在這項研究中JelRh視蛋白中的反離子對于穩定質子化的視黃醛席夫堿以及對光譜調諧、異構化控制和激活控制等功能的影響。我們通過研究JelRh視蛋白的視黃醛結合口袋的結構資訊，特别是其TM2區域中的反離子，探索了視黃醛的異構化過程以及與之相關的構象變化。
通過将JelRh與已知的脊椎動物視蛋白（BovRh）和無脊椎動物視蛋白（SquRh）進行比較，我們的目标是确定JelRh是否顯示與它們相似的光譜特性。
參考文獻
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