鈣激活氯離子通道 TMEM16A 開放狀态下藥物口袋的鑒定
前言：鈣激活氯離子通道TMEM16A是治療高血壓、分泌性腹瀉和多種癌症的潛在藥物靶點。然而，所有報道的TMEM16A結構都是關閉或失效的狀态，藥物分子直接抑制開放狀态缺乏可靠的結構基礎。是以，揭示TMEM16A在開放狀态下暴露的可藥物靶點對于了解蛋白質-配體互相作用和促進合理藥物設計非常重要。
使用增強采樣算法和分段模組化重建了鈣激活的TMEM16A開放構象。此外，還确定了一個開放狀态的可藥物靶點，并篩選出一種有效的TMEM16A抑制劑——拓撲異構酸，它是一種傳統草藥單體的衍生物。
TMEM16A是一種鈣激活氯離子通道(CaCC)，廣泛表達于各種細胞中，受到胞内Ca2+上升的激活。TMEM16A在各種生理功能中扮演着重要的角色，包括神經信号傳遞、平滑肌收縮的控制和上皮細胞分泌的調節。
在真核生物中，TMEM16A有9個相關家族成員，其中功能比較清晰的是形成CaCCs的TMEM16A和B，以及作為脂質翻轉酶的TMEM16D-F、J-K。最近，TMEM16A及其家族成員的結構已被确定，并闡明了鈣激活的門控機制。
結構基于的藥物設計和篩選為TMEM16A抑制劑的發現提供了重要幫助，這主要依賴于通道在鈣離子結合或無鈣狀态下的配體結合口袋。先前在TMEM16A的鈣結合狀态下鑒定出一個位于細胞外前庭區的非選擇性抑制劑結合口袋。
基于這個結合口袋進行虛拟篩選，在天然産物庫和已上市藥物庫中篩選出了兩個抑制劑Theaflavin和Zafirlukast。同時，張和白發現，在細胞外前庭的幾個氨基酸殘基（D383、R515、R535、K603、E623、E624）的突變顯著降低了幾個TMEM16A抑制劑包括Rutecarpine、Cepharanthine和Nuciferine的效力，進一步證明了細胞外前庭是可藥物靶向的口袋。
2022年，TMEM16A與抑制劑1PBC的複合物結構被解析出來，顯示1PBC結合在細胞外前庭下方并阻塞了離子導通孔，揭示了一個新的抑制劑結合口袋。為了抑制離子通道，抑制劑必須要麼穩定通道的關閉狀态，要麼在其打開狀态下阻塞離子導通孔。
然而，所有報告的TMEM16A結構，包括複合物結構，都處于關閉或失效狀态。是以，揭示TMEM16A在打開狀态下顯露的可藥物靶向的口袋對于了解蛋白質-配體互相作用并促進合理藥物設計非常重要。
将Apo和Holo狀态在200 ns時的快照與TMEM16A的開放狀态和失活狀态（PDB ID：5OYB）進行了疊加。與模拟的初始開放狀态結構相比，Apo和Holo狀态中TM4的RMSD值大于2 Å，而Apo狀态的RMSD值甚至更高。這表明TM4離開TM6時并不穩定。
與失活狀态結構（PDB ID：5OYB）相比，Apo和Holo狀态中TM4的RMSD值接近2 Å。這表明TMEM16A的冷凍電鏡構象是一個能量穩定狀态，并且解釋了獲得開放狀态構象的困難。在所有Holo系統中，Etoposide的RMSD值均小于1.5 Å，沒有大的波動，說明Etoposide在該口袋中的結合非常穩定，推測，當通道處于開放狀态時，Etoposide可以進入口袋并阻塞離子通道，進而抑制TMEM16A電流。
進行了總時間為600 ns的模拟，以評估Etoposide在這個結合口袋中的穩定性。模拟過程中Etoposide的RMSD收斂在0.5-1.4 Å。使用Etoposide與R535之間的距離和e/d/f環之間的角度作為反應坐标，建構了Etoposide構象的自由能景觀。
提取了Etoposide最穩定的狀态進行互相作用分析。Etoposide的a/e/d環形成氫鍵與R535/K603/R621/E633，并與其他周圍殘基發生了廣泛的範德華互相作用。在此基礎上，依次将R535、K603和R621突變為丙氨酸。
電生理實驗顯示，R535A/K603A/R621A突變對Etoposide的影響比T518A/N546A/E633A要弱，這表明Etoposide更可能結合到開放狀态的藥物口袋，而不是失活狀态。考慮到R535/K603/R621的突變也對Etoposide活性産生了微弱的影響，推測R535/K603/R621可能是Etoposide結合TMEM16A通路的殘基，但不是最貢獻穩定Etoposide結合的殘基。
結論：通過揭示TMEM16A的開放狀态結構和可藥物靶點，可以為進一步研究和設計針對TMEM16A的藥物提供重要的參考和基礎。這對于開發新的TMEM16A抑制劑以及治療相關疾病具有潛在的臨床意義。
