撰文/西風吹行客
編輯/西風吹行客
（百慕大草）
前言
百慕大草（Cynodon dactylon L.）是一種重要的暖季草坪草品種，匍匐生長發育良好，為百慕大草植物通過無性克隆生長快速繁殖奠定了基礎。然而，百慕大草匍匐的生長發育在分子水準上仍然知之甚少。
我們本次的研究将全面分析百慕大草品種陽江速生匍匐中蛋白質的乙酰化和琥珀酰化修飾。
并采用液相色譜-串聯質譜聯用法分别成功鑒定了4657種蛋白質上的1914個賴氨酸乙酰化位點和226種蛋白質上的128個賴氨酸琥珀酰化位點。
此外，我們還發現了78種蛋白質和81個賴氨酸位點同時被乙酰化和琥珀酰化。功能富集分析表明，乙酰化蛋白調節碳水化合物代謝和蛋白質周轉的不同反應，而琥珀酰化蛋白主要調節檸檬酸鹽循環。
這些研究結果部分解釋了丁酸鈉和丙二酸鈉處理下百慕大草匍匐莖的不同生長障礙，它們分别幹擾蛋白質乙酰化和琥珀酰化。
此外，還有140種乙酰化蛋白和42種琥珀酰化蛋白在其他草種中具有類似修飾的直系同源物。
研究中位點特異性突變結合酶活性測定表明，過氧化氫酶的保守乙酰化和蘋果酸脫氫酶的琥珀酰化均抑制了它們的活性，進一步暗示了兩種修飾的重要調控作用。
百慕大草的生長環境和繁殖特點
百慕大草（Cynodon dactylon L.）作為一種具有巨大經濟價值的多年生暖季草坪草種，廣泛用于世界各地溫暖地區的公園、高爾夫球場、運動場和家庭草坪的草坪種植。
與水稻、小麥、玉米、高粱和大麥等馴化谷類草不同，百慕大草植物通常通過從斯托隆節點克隆再生幼苗進行無性繁殖。
憑借這種繁殖特性，百慕大草可以通過不斷生成和再生匍匐，在空曠的地方快速傳播，為百慕大草的草坪型品種形成均勻美觀的草坪奠定了基礎。
在過去的幾年中，高通量轉錄組學和蛋白質組學研究揭示了代謝調節在百慕大草匍匐生長中的特化和匍匐生長中的關鍵作用。
例如，比較轉錄組分析表明，與直立生長的野生種質相比，木質素生物合成在匍匐生長的野生種質中受到損害。比較蛋白質組學和酶分析表明，匍匐在匍匐中澱粉積累高度活躍，而在芽中糖酵解活性更為突出。
與地下生長的匍匐莖相比，地上生長的匍匐莖具有大量的葉綠素和參與光合作用的酶的高表達，這表明匍匐莖可能起到額外的光合器官的作用。然而，調節百慕大草不同代謝反應的詳細分子機制仍然知之甚少。
在目前的研究中，我們對快速生長的百慕大草匍匐中的蛋白質賴氨酸乙酰化和琥珀酰化修飾進行了全局鑒定。共鑒定了4657種蛋白質上的1914個賴氨酸乙酰化位點和226種蛋白質上的128個賴氨酸琥珀酰化位點。
系統分析了兩種PTM在速生百慕大草匍匐莖中的特性和功能，并評價了兩種PTM對關鍵酶活性的影響。
這項研究的結果不僅首次全面了解草坪草的乙酰素和琥珀素，而且擴充了對快速生長植物器官代謝調節的了解。
幹擾蛋白質賴氨酸乙酰化調節百慕大草的生長
百慕大草是一種暖季草坪草，具有多種應用。通過匍匐生長的快速生長和不斷分化，百慕大草植物可以無性繁殖。
在過去的幾年中，已經發現許多外源小分子在正常和脅迫條件下影響百慕大草植物的生長和發育。
褪黑激素也被發現可以緩解H2O2-調節百慕大草中的植物生長、細胞損傷和活性氧積累。此外，蛋白磷酸酶抑制劑NaF和蛋白激酶抑制劑星形孢菌素均抑制百慕大草的正常生長和澱粉積累。
在這項研究中，還觀察到組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鈉和琥珀酸脫氫酶抑制劑丙二酸鈉調節百慕大草植物的生長，尤其是匍匐動物。
有趣的是，兩種鹽在低濃度（10 mM）下促進匍匐生長，但在高濃度（50 mM）下抑制匍匐生長，這與高濃度丙二酸對拟南芥幼苗生長的毒性作用一緻。
此外，丁酸鈉同時影響可溶性糖和蛋白質含量，而丙二酸鈉對可溶性蛋白質含量影響不大。
由于百慕大草品種陽江是一種耐鹽品種，在50 mM NaCl處理下保持正常生長，這些結果表明丁酸鈉和丙二酸鈉在調節百慕大草匍匐生長方面的功能不同，可能分别通過調節必需蛋白質的乙酰化和琥珀酰化修飾。
琥珀酰化修飾
我們已經在不同的植物物種中進行了乙酰體和琥珀酰體分析實驗。在這些研究中，紙桑中鑒定出多達3179種乙酰化蛋白，而據報道，水稻和草莓中琥珀酰化蛋白的最大和最小數量分别為2593種和116種。
在這項研究中，在快速生長的百慕大草匍匐中成功鑒定了1914種乙酰化蛋白和128種琥珀酰化蛋白。
值得注意的是，琥珀酰化蛋白的數量遠低于乙酰化蛋白的數量。
盡管兩種PTM的免疫親和富集效率可能不同，進而導緻兩種鑒定結果之間存在差異，但考慮到紙桑樹中鑒定的琥珀酰化蛋白數量也遠低于乙酰化蛋白，是以不能排除兩種PTM在百慕大草匍匐莖中固有的不均勻分布。
百慕大草匍匐中每個蛋白質的平均乙酰化和琥珀酰化位點分别為21.2（43/4657）和1914.1。這些數字與其他植物物種的結果相當。
例如，大豆葉片中每種蛋白質的平均乙酰化位點為128.2（05/3148），而奧利弗桫椤中每種蛋白質的平均琥珀酰化位點為16.1（79/653）。
值得注意的是，在百慕大草匍匐中，兩種蛋白質被鑒定為具有28多個琥珀酰化位點。這一結果進一步支援了蛋白質賴氨酸乙酰化和琥珀酰化可能以不同頻率存在于百慕大草匍匐中的懷疑，因為單個蛋白質的多個琥珀酰化肽很少從低效的免疫親和富集過程中獲得。
此外，氨基酸組成分析表明，酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸經常分布在乙酰化賴氨酸位點周圍，而異亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸經常分布在百慕大草匍匐酮琥珀酰化賴氨酸位點周圍。
在其他大規模乙酰化和琥珀酰化鑒定研究中也發現了相似的氨基酸組成。例如，在 P. asperata 中，乙酰化賴氨酸位點周圍經常檢測到酪氨酸和賴氨酸殘基，而在 C. cathayensis 和 D. officinale 中，在琥珀酰化賴氨酸位點周圍經常檢測到谷氨酸。
這些結果共同表明，不同的植物物種中可能存在一種保守機制，以添加和去除特定蛋白質的乙酰化和琥珀酰化修飾。
考慮到蛋白質酰基轉移酶和琥珀酰基轉移酶在植物中仍未鑒定，對被特定氨基酸包圍的賴氨酸殘基的偏向非酶修飾可能是一種可能的機制。
百慕大草匍匐中賴氨酸乙酰化和琥珀酰化蛋白的鑒定
盡管已經在幾種植物物種中成功進行了大規模的乙酰基和琥珀酰基研究，但特異性乙酰化和琥珀酰化修飾的詳細調控功能僅在少數植物中表征。
例如，K407和K425處的乙酰化增加了三角假單胞菌中長鍊酰基輔酶A合成酶的酶活性。
172個賴氨酸位點的乙酰化均降低了拟南芥中MDH蛋白的草酰乙酸還原活性，而K32處MDH蛋白的乙酰化增加了其在拟南芥中的活性。
K55的琥珀酰化降低了水稻CAT蛋白的酶活性，而K241或K10的琥珀酰化增加了水稻谷胱甘肽S-轉移酶蛋白的酶活性。
在這項研究中，我們表達并純化了wt和乙酰化/脫乙酰化模拟CAT蛋白以及wt和琥珀酰化/去琥珀酰化模拟MDH蛋白。酶法測定表明，CAT在K332處的乙酰化和MDH在K7處的琥珀酰化都降低了它們的酶活性。
考慮到這些結果是從體外純化蛋白中獲得的，乙酰化模拟CAT蛋白和琥珀酰化模拟MDH蛋白的酶活性降低可能僅由蛋白質電荷的變化引起，而脫乙酰化/去琥珀酰化模拟突變對酶活性的影響很小，因為兩種蛋白質的電荷保持不變。
有趣的是，這兩個修飾位點都儲存在三種草的快速生長器官中。先前的研究表明，缺乏線粒體MDH蛋白的拟南芥突變植物表現出小、生長緩慢和種子發芽後生長表型受損。
而拟南芥過氧化氫酶三重突變體也表現出嚴重的氧化還原紊亂和生長缺陷，這意味着這兩種酶在快速器官生長中起重要作用。
本研究結果進一步表明，兩種酶的活性可分别通過保守乙酰化和琥珀酰化調控，為植物生長發育中的動态代謝調控提供新的思路。
我們的分析成功地鑒定了百慕大草快速生長的匍匐中的數千種賴氨酸乙酰化修飾和數百種賴氨酸琥珀酰化修飾，然而，許多乙酰化蛋白質和可能具有重要功能的琥珀酰化蛋白質可能無法确定，因為它們與親和抗體的豐度低或反應性差。
另一方面，許多研究表明乙酰化和琥珀酰化修飾都存在于非常低的化學計量中。
此外，實驗證據進一步表明，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）在拟南芥中以非常低的化學計量被乙酰化，不能有意義地影響其在體内的酶活性，乙酰化水準的适度增加不會顯着改變其最大活性。
考慮到純化的乙酰化/脫乙酰化模拟CAT蛋白和琥珀酰化/脫琥珀酰化模拟MDH蛋白隻能模拟乙酰化和琥珀酰化修飾對兩種蛋白質的100%和0%化學計量，兩種修飾對體内酶活性的實際影響可能弱于體外酶法測定結果。
未來，我們不僅要利用最先進的質譜技術和高親和力抗體進一步探索未知的乙酰化和琥珀酰化修飾。
還要使用同位素标記的肽标準品确定感興趣的修飾的化學計量，以獲得其實際的生物學功能。
結論
綜上所述，1914年百慕大草匍匐中首次鑒定出具有4657個賴氨酸乙酰化位點的乙酰化蛋白和具有128個賴氨酸琥珀酰化位點的226個琥珀酰化蛋白。
乙酰化和琥珀酰化的蛋白質位于不同的細胞區室中，形成複雜的互相作用網絡并參與不同的細胞過程。
過氧化氫酶的保守乙酰化和蘋果酸脫氫酶的琥珀酰化進一步揭示了體外酶活性降低，為乙酰化和琥珀酰化介導的百慕大草斯托隆生長在生化水準上的調節提供了初步證據。
未來，利用現有的基因組資源和遺傳轉化技術，可以闡明百慕大草植物中特異性乙酰化和琥珀酰化修飾的詳細生理功能。