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Abstract
侵入式腦電極是體内與單個神經元電接口的唯一手段，但是它們的記錄效率和生物相容性使其在科學和臨床應用中是有局限的。文章發現具有亞細胞尺寸、超柔韌性和細胞外科手術印記(cellular surgical footprints)的納米電子線（nanoelectronic thread，NET）電極可形成可靠的、無膠質瘢痕的神經整合(glial scar–free neural integration)。研究者證明了NET電極可以在單個單元水準可靠地檢測并跟蹤數月之久，在長期植入過程中，NET的阻抗、噪聲水準、單個機關的記錄産量以及信号幅度均保持穩定。體内雙光子成像和死後組織學分析顯示，NET探針與局部細胞和脈管系統網絡無縫地與亞細胞整合。
一、INTRODUCTION
長期植入的電極通過擷取活體大腦中各個神經元的電活動，是最重要的神經技術之一。盡管有時會觀察到長期電記錄，但慢性記錄容量有較大變化的情況常被報告，這主要是由于：無論是短期還是長期，正常電極和大腦組織之間的界面都缺乏穩定性。
正常的神經植入物的體積和手術印記遠大于細胞和毛細血管，進而引起局部細胞和血管網絡的實質性損傷和破壞。此外，這些探針比宿主腦組織的硬度明顯更高，後者的自然微動會在界面處引起強烈的壓力。
在短期内，電極從其目标神經元産生的位移會導緻時間尺度上突然的波形變化，而時間尺度可能長達數小時之久，進而阻止了數天甚至更長時間内對單個神經元的可靠跟蹤。
從長遠來看，植入物的存在會引起反複的細胞和血管損傷，引起持續的發炎群組織反應，并最終導緻植入物附近的神經元降解和神經膠質瘢痕形成。這些慢性惡化在電記錄中表現為記錄保真度的下降，包括阻抗增加、噪聲水準升高、信号幅度下降和機關記錄減少。
過去十年中的大量研究工作表明，減小神經探針的尺寸和剛性可以改善神經界面。
最近的工作表明，大孔電子器件和由碳纖維制成的超小型微電極大大降低了組織反應。
但是，可靠的腦探針能夠長時間地檢測和跟蹤同一神經元的活動，并且需要沒有上述任何慢性有害作用，是以需要無縫的生物整合，這些都尚待證明。
考慮到以前在改善神經電極界面方面的努力，我們确定了以下關鍵方面，以建立可靠且無膠質瘢痕的神經探針界面:
- 探針的尺寸與普通細胞和毛細管的尺寸相當或更小，是以對宿主生物基質的幹擾極小探針的尺寸與普通細胞和毛細管的尺寸相當或更小，是以對宿主生物基質的幹擾極小；
- 探針具有足夠的靈活性，以確定完全順應組織的微動，并将探針-組織的界面力降低到細胞力的範圍（nanonewtons）；
- 植入過程中的手術損傷小于ca. 100μm，以使組織得以恢複；
- 該探頭具有機械和電氣方面的堅固性，可在生理條件下長期發揮功能。
為了滿足這些嚴格的要求，我們開發了超柔性納米電子線（NET）腦探針以及具有細胞大小的手術腳印的植入政策。
我們通過長期的電記錄和探針-組織界面的全面表征，驗證了我們的方法在齧齒動物（小鼠）模型中的有效性。
二、Results
我們使用多層，無基闆的結構和專門的光刻技術（材料和方法）設計和制造了兩種類型的NET腦探頭NET-50和NET-10。
如圖1所示，NET-50具有四層布局，總厚度為1μm，平均寬度為50μm，具有八個電極的線性陣列。NET-10的橫截面為10μm×1.5μm，據我們所知，這是在所有已報道的神經探針中最小的，其有七層，在兩個相對的表面上容納四個電極。
▲原文中的圖1：NET神經探針的結構
A和B. 基闆上的預制NET-50和NET-10探針。
C和D. 分别由（A）和（B）中的虛線框标記的兩個電極的放大視圖。箭頭表示“vias(導通孔)”。
E.（A.頂部）和（B.底部）中探針橫截面的示意圖，突出了多層布局。顔色代碼：灰色，絕緣；橙色，互連；藍色，電極。沒有按比例繪制。
F. NET-50探針通過原子力顯微鏡測得的沿（C）中虛線的高度輪廓。
G. NET-50探針懸浮在水中。打結的曲率小于50μm，以說明其柔韌性和耐用性。
H. 多個NET-10探針懸浮在水中。箭頭表示探針。比例尺—100μm（A），50μm（B，G和H）和10μm（C和D）。
為了最小化體積和最大程度地提高靈活性，兩種類型的電極和互連層均位于不同層上，這些層和互連層之間通過絕緣層的通孔進行電連接配接。
NET-50探針的設計類似于常用的矽神經探針（例如，NeuroNexus A8×8設計中的單個平闆），而NET-10探針被設計為提供與四極體(tetrodes )相似的記錄特性，兩種探針的尺寸都大幅減小（圖S1）。
與先前展示的神經探針相比，NET探針顯着降低了有效彎曲剛度和每個電極的組織位移，進而顯着提高了生物相容性（圖S2）。
具體而言，彎曲剛度降低到了10^-15 N·m2個數量級，這将探針-組織的界面力降低到了納米牛頓範圍（圖S3），與單細胞牽引力相當。
▲原文中的圖S1
▲原文中的圖S2
▲原文中的圖S3
NET探針的超柔韌性從機械上排除了它們自支撐性穿透腦組織的能力。
以前提供柔性探針的政策包括臨時更改探針的剛度，更常見的是将探針臨時固定到剛性穿梭裝置上。
但是，先前研究中使用的大多數穿梭裝置的尺寸都大于100μm，遠大于NET探針的尺寸，并導緻無法恢複的損壞和持續的瘢痕形成。
通過使用臨時接合機制(temporary engaging mechanism )（圖2A）和由直徑小至7μm的碳纖維和鎢微絲制成的穿梭裝置，我們将植入占位面積減小了約10倍，達到了細胞尺寸（圖2B）。
▲原文中的圖2：NET探針的植入程式
A. 示意圖，顯示了臨時接合機制。箭頭表示植入物的進入位置（實線），穿梭裝置的輸送路徑（灰色）和齧合的NET探針的路徑（虛線）。
插圖：虛線正方形的放大圖，突出顯示了微柱與穿梭裝置末端的NET探針上的微孔齧合。
B. 安裝在微操縱器末端的直徑為7μm，長度為3
mm的典型碳纖維穿梭裝置的照片。比例尺，500μm。插圖：穿梭裝置尖端處直徑為2μm，高度為5μm的微磨柱的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。比例尺，2μm。
C. 光學顯微照片，顯示NET-50（頂部）和NET-10（底部）探針中的接合孔，其直徑略大于柱子的直徑，如箭頭所示。
D和E. NET-50和NET-10探針（綠色）的僞彩色SEM圖像（綠色），該探針附着在帶有20μm鎢微絲（D，紫色）和10μm碳纖維（E，紫色）的穿梭裝置上
顯示它們的超小尺寸。比例尺，50μm（D）和20μm（E）。
F和G. 顯微照片顯示NET-50和NET-10探針均成功地遞送到了活的小鼠大腦中，而對急性組織的損害最小。箭頭表示傳導入口站點。比例尺為100μm（F）和50μm（G）。
H. 顱骨固定示意圖，可容納神經探針的連接配接器和允許光學進入的玻璃窗。沒有按比例繪制。
I. 典型的手術後鼠的照片，該鼠帶有植入的NET探針和安裝在頂部的玻璃窗。插圖：頂部，安裝在頭骨上的電纜連接配接器的圖像；玻璃窗的底部放大圖，其中箭頭表示植入的探針。
J. 由植入的NET-50探針上的八個電極記錄的典型機關活動。應用了高通濾波器（300 Hz）。
通過使用聚焦離子束（focused ion beam, FIB）制造的每個穿梭裝置末端的微柱，可以實作接合機制（圖S4）。在傳導過程中，微柱插入微孔中（圖2，C至E），并将NET探針拉至所需深度（圖S1），然後穿梭裝置脫離并縮回（材料和方法）。整個插入占用空間小至跨度為ca. 10μm（圖2，D和E），僅導緻細胞大小的手術損傷，正如如出血少（圖2，F和G）和插入力小（圖S4）所證明的。
利用超柔韌性和超小尺寸，我們通過NET植入物适應了慢性光學通路(chronic optical access)（圖2，H和I），進而可以通過體内兩光子（2P）成像來監視組織-探針界面。在整個手術過程中都保持了電氣完整性，植入的電極很容易檢測到機關活動（圖2J）。
▲原文中的圖S4
我們接下來評估了 NET 探針的長期可靠性。
我們将 16 個探針植入 7 隻小鼠的體感和視覺皮層，共包含 96 個連接配接電極中的 80 個（83.3% 的制造良率）。
我們每月對麻醉動物進行兩次電記錄，持續了 4 個月。我們觀察到記錄性能在最初的 1.5 個月内有所改善，然後在以下方面保持穩定至少另外 2.5 個月（直到我們的實驗期結束）。
首先，所有 80 個電極的平均阻抗和噪聲水準在前 1.5 個月内下降并保持穩定（圖 3A）。
其次，檢測單元事件和可排序的單單元動作電位 (AP) 的電極數量在前 1.5 個月增加，然後保持在同一水準（圖 3B；單元活動的示例包括不可排序的尖峰和可排序的單個單元 AP(sortable single-unit action potentials, AP: action potentials) 的單元活動的示例在圖 S5 中詳細說明）。多單元 (~75%) 和可排序的單個單元記錄 (~25%) 的産量與用于麻醉下自發測量的傳統矽探針相當 ，但具有前所未有的慢性穩定性(chronic stability)。
最後，我們檢測到來自 19 個電極的可排序 AP 波形，平均振幅和信噪比 (SNR) 在整個 4 個月期間保持穩定（圖 3C）。
▲原文中的圖 3：植入的 NET 電極的慢性記錄和電特性
A. 作為時間函數的 80 個植入電極的阻抗（紅色）和噪聲水準（藍色）。誤差線标記 SD.
B. 記錄機關活動（紅色）和可排序的單個機關AP（橙色）作為時間函數的電極數量（左）和百分比（右）。
C. n = 19 個電極作為時間函數記錄的單個單元 AP的平均峰谷振幅（紅色）和 SNR（藍色）。誤差線表示 SD。
D. 一個電極在 4個月内每月兩次測量，記錄了不可排序的的尖峰（藍色）和可排序的的 AP 波形（紅色）。 波形是從 3 到 9 分鐘的記錄段中隔離和平均的。豎條: 200 μV；橫條: 1 毫秒。
E. (D) 的所有波形的主成分 (PC) 分析。 點：PC 的中心。橢圓：PC 分布的 2σ 輪廓。顔色: 編碼時間戳。
插圖：單個單元波形的 PC 中心随時間的演變。
我們跟蹤了所有 80 個電極 4 個月，并在表 S1 和圖 S5中總結了它們随時間推移的動物和探針特異性性能。
盡管不同動物的功能電極數量和機關檢測率存在差異，但在所有動物中均觀察到機關檢測随時間的穩定性和一緻性。
例如，圖 3D 顯示了來自電極的兩個月的測量值，該電極檢測到典型的尖峰事件和所有電極中具有最高 SNR (>30) 的可分排序AP 波形。可排序 AP 波形的持續高 SNR 表明放電神經元在慢性記錄的整個持續時間内都保持靠近電極。所有測量的組合主成分分析顯示，簇中心的平均位置偏移在連續測量之間有很大程度的重疊，相當于平均簇分布的 0.88σ（圖 3E），表明波形是由同一神經元生成的。此外，我們反複檢測到來自一個電極的中間神經元波形（圖 S6），這是罕見事件（<10%），并作為跟蹤同一神經元的高機率标記。
▲原文中的圖S5
▲原文中的圖S6
此外，我們觀察到 AP 波形的持續特征，而除一個電極外，所有電極都發生了微小的可追蹤變化（19 個中的 18 個，94.7%；圖 S7）。
值得注意的是，與以前通常觀察到振幅随時間減小的神經元探針相比，大多數 NET 電極記錄的 AP 波形具有峰谷振幅的非單調變化(nonmonotonic changes in peak-valley amplitude)。
證據強烈表明 NET 探針與神經元形成了一個非降解的、緩慢進化的界面。
為了直接研究探針-組織界面的性質，我們在手術後長達 3.5 個月内，通過在植入部位的體内 2P 成像監測了 NET 探針周圍的毛細血管、星形膠質細胞和神經元（材料和方法）。
圖 S8 顯示了血管系統的演變，表明手術損傷導緻植入後血腦屏障 (blood-brain barrier, BBB) 的輕微局部滲漏，持續最多 1 個月，并随着血管重塑而完全修複。
▲原文中的圖S8
如圖 4（A 和 B）和圖 S2 所示，兩種類型的 NET 探針都嵌入毛細血管中， 2 個月中毛細血管一直具有正常密度、形态和完整的 BBB 。我們通過線掃描( line scans )（圖 4的C 和 D) 測量了血液流速，并在 (420 ± 180 μm/s) 附近和遠離 (450 ± 210 μm/s) 探頭（材料 和方法），确認緊鄰探頭的毛細血管灌注正常。這與傳統微電極形成強烈對比，傳統微電極在界面的慢性體内成像中觀察到連續的 BBB 洩漏。
▲原文中的圖 4：慢性探針-組織界面處細胞和血管結構的成像和跟蹤
A和B. 植入後 2 個月，通過體内 2P 顯微鏡圍繞 NET-50（A）和 NET-10（B）探針（紅色）對血管系統進行三維（3D）重建，突出顯示完全恢複的毛細血管網絡（綠色）。
圖像堆棧：大腦表面下方 0 到 400 μm (A) 和 100 到 320 μm (B)。有關 (B) 的完整視圖，請參閱圖 S2。
C. 200 μm 深的 2P 圖像标記了 (D) 中線掃描的毛細管（虛線）的位置。
D. 線掃描矩陣顯示紅細胞的運動為暗條紋，其斜率給出了血流速度。
E. 植入後 3.5 個月腦表面以下 210 至 250 μm 的體内 2P 圖像的投影，顯示正常的星形膠質細胞和毛細血管。明亮的“z”形物體是一個折疊的 NET-50 探頭。毛細血管可見為黑線。右圖：虛線區域的放大視圖。有關大腦表面下方 125 到 360 μm 的完整圖像堆棧，請參閱圖 S3。
F. 免疫化學标記的橫截面切片（30 μm 厚，植入後 5 個月）的共聚焦顯微照片的投影。僞色代碼(False-color code)：橙色，NeuN，标記神經元核；綠色，lba-1 标記小膠質細胞。白色箭頭表示小膠質細胞體。橙色箭頭表示與 NET 探針接觸的神經元。
G和H. 植入後 2 個月和 2.5 個月，分别在 NET-50 探針 (G) 和兩個 NET-10 探針 (H) 周圍的 Thy1-YFP 小鼠中神經元（黃色）的體内 2P 圖像的 3D 重建。探針為紅色并用箭頭表示。
成像深度：（G）腦表面以下 130 至 330 μm，（H）腦表面以下 110 至 260 μm。
I和J. 分别來自 (G) 和 (H) 中相同區域的代表性 2P 圖像，顯示神經元在植入後的不同時間被重複識别。紅色虛線标記探針的邊緣。箭頭和虛線圓圈分别突出顯示神經元的目前位置和先前位置。
有關完整的圖像堆棧，請參閱圖 S4 和 S5。
所有比例尺為50 μm。
我們在植入 NET-50 探針後 3.5 個月通過體内染色（材料和方法）對星形膠質細胞進行成像（圖 4E 和圖 S3）。
我們注意到，成像部分在植入過程中無意折疊，曲率低于 100 微米，這設定了 NET 探針的組織探針應力上限。我們觀察到探針附近的星形膠質細胞僅包圍具有正常密度和形态的毛細血管（類似于圖 S9 中所示來自同一隻小鼠的對側半球的星形膠質細胞）。
我們還在植入後 5 個月進行了屍檢組織學（材料和方法），并觀察了探針附近的正常神經元密度（圖 S10A）和靜息小膠質細胞（圖 4F）。
值得注意的是，與探針的直接接觸不會影響神經元的活力，也不會激活小膠質細胞（圖 4F）。
這些結果表明NET 探針具有前所未有的生物相容性，因為它們保持正常的血管和細胞結構，并且在界面處不會引起可觀察到的慢性組織反應。
▲原文中的圖S9
▲原文中的圖S10
為了揭示神經接口的演變，我們在植入後長達 3 個月内反複對兩種類型的 NET 探針附近的神經元進行成像，并将它們相對于一些代表性神經元和毛細血管的位置作為位置标記進行比較（圖S4 和 圖S5 、圖4的G—J)。
我們觀察到最初在探針附近成像的所有神經元都在後來的成像會話中被識别出來，這進一步證明 NET 探針不會引起慢性神經元丢失。
此外，盡管大多數神經元是相對靜止的，但有些神經元在幾周的過程中表現出緩慢的遷移（高達約 10 μm）（圖 4：I 和 J）。值得注意的是，我們觀察到它們的遷移軌迹沒有偏向于移向或遠離 NET 探針。
參考文獻
Luan, L. , Wei, X. , Zhao, Z. , Siegel, J. J. , Potnis, O. , & Tuppen, C. A. , et al. (2017). Ultraflexible nanoelectronic probes form reliable, glial scar–free neural integration. Science Advances, 3(2), e1601966.
圖源/百度圖檔