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近期，ChatGPT在問答領域十分火熱，ChatGPT的背後是人工智能(AI)的功勞。目前，人工智能已經被廣泛應用與科學研究中，随着人工智能和深度學習模型的最新進展被訓練成識别多元成像和生物資料中的細微差别特征，結合表型和基因組資料流的機器學習(ML)有望改變下一代微生物培養物。宏基因組學提供了廣泛調查從土壤群落到腸道微生物組的各種微生物生态系統組成的能力。然而，微生物需要被分離和培養，以機械地剖析它們在栖息地中的功能作用以及發生的無數種間過程。依靠“蠻力”随機摘菌落的傳統栽培方法繁瑣且勞動密集。傳統的使用 96 或 384 孔的基于稀釋的連續分離方法是資源密集型的，導緻從群體中重複分離相同的優勢菌株。微流體系統能夠在納升反應器中生長，但克隆分離株難以提取。鑒于典型的微生物組可能包含數百到數千種表現出長尾豐度分布的獨特物種（即，很少占主導地位，而大多數是罕見的），通過系統培養組學生成全面的菌株集合仍然是一個重要而突出的挑戰。
來自美國哥倫比亞大學的Harris H. Wang團隊開發了一個開源的高通量機器人菌株分離平台，可用于按需快速生成分離物。本研究開發了一種機器學習方法，利用菌落形态和基因組資料來最大限度地提高分離出的微生物的多樣性，并能夠有針對性地挑選特定的屬。将該平台應用于20名人類的糞便樣本，産生了個性化的腸道微生物生物庫，總計26997個分離物，占所有豐富分類群的80%以上。對超過100000個目測捕獲的菌落的空間分析揭示了反刍球菌科、類杆菌科、芽孢杆菌科和雙歧杆菌科之間的共生模式，表明了重要的微生物互相作用。這種培養組學架構應使新的研究工作能夠系統化基于成像的表型的收集和定量分析，并為許多新興微生物組研究提供高分辨率基因組學資料。相關工作以題為“High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning”的文章發表在2023年2月20日的國際頂級期刊《Nature biotechnology》。
1. 創新型研究内容
CAMII平台包括四個關鍵要素(圖1):(1)收集菌落形态資料的成像系統和人工智能引導的菌落選擇算法；(2)用于高通量分離和排列分離株的自動菌落挑選機器人；(3)用于快速生成所選分離株基因組資料的成本效益管道；(4)具有可搜尋菌落形态、表型和基因型資訊的實體分離生物庫和數字資料庫。是以，這種端到端的培養組學平台可以從不同的輸入微生物組中産生分離的收集物，以最大限度地減少人工勞動。整個成像和隔離系統采用了安裝在厭氧室中的現有元件，可實時控制溫度、濕度和氧氣水準。CAMII機器人的隔離通量為每小時2000個菌落，每次運作可處理12000個菌落，比人工隔離菌落的能力高20倍，速度更快。為了確定本研究的基因組分析能力與機器人分離通量相比對，還開發了一種低成本、高通量測序管道，利用液體處理自動化來生成16S rRNA測序或全基因組測序的條形碼文庫。在Illumina HiSeq平台上，每個分離物的菌落分離和基因組DNA (gDNA)制備成本為0.45美元，16S rRNA測序成本為0.46美元，而商業化的覆寫>60×的WGS成本為6.37美元，這比目前的商業服務便宜得多。另外，CAMII平台的一個關鍵獨特特征是成像系統，該系統收集并學習細菌菌落的形态資料。具體而言，顯示菌落高度、半徑和圓形度的透照圖像和顯示顔色和複雜形态特征(如起皺)的落射圖像在CAMII上捕獲，以産生多元和可量化的形态資料集。本研究開發了一個定制的菌落分析管道，可以沿着不同的形态特征分割菌落。
圖1 一種利用表型和形态特征的資料驅動微生物分離政策
雖然來自不同人的微生物組可能共享相似的細菌種類，但屬于這些種類的菌株對于個體來說是高度獨特的，并且可能在同一宿主中共殖多年。本研究展示了CAMII産生20名健康人的個性化腸道分離物集合的效用。分析了總共102071個菌落，挑選26997個菌落并通過16S rRNA測序進行分類鑒定(圖2)，産生394個獨特的ASVs，其覆寫了健康共生腸道微生物組的廣泛多樣性。為了評估該分離物收集的全面性，本研究通過批量16S rRNA測序計算了相應糞便樣品中分離的ASV的豐度。值得注意的是，對于每個個體，有80.9±9.4%的ASV在整個分離物集合中至少出現一次。來自每個人的分離物平均構成該個體中細菌ASV總豐度的45.6±21.6%。此外，分離物收集物和大量糞便樣本的比較顯示:大多數高度豐富和流行的ASV在收集物中至少被分離一次。先前的研究發現，許多來自不同環境的微生物很難在實驗室中培養。是以，本研究探究了利用本研究的系統生成的分離物生物庫來評估人類腸道微生物組的可培養性，并在實驗環境中識别仍然難以分離的細菌ASV。在所有20個個性化分離物收集物中，确定了是否在生物庫中發現了大量糞便物質中的豐富ASV (平均相對豐度> 0.1%)。
圖2 為20個人生成個性化腸道隔離生物庫
從微生物組樣品中集中培養感興趣的細菌對于機理研究可能是至關重要的。不幸的是，目前缺乏以特定方式選擇性培養大多數細菌物種的能力。是以，挑選大量菌落并依靠統計機率是目前獲得感興趣細菌的唯一可行的解決方案。然而，這種政策通常太消耗資源，因為它可能需要手動挑選數千個菌落。CAMII提供了一種ML引導的自動化菌落選擇方法，該方法基于将分類學身份與菌落形态聯系起來，是以在理論上可以增強靶向分離。為了測試這一點，本研究系統地探索了深層腸道分離物的收集，以分析形态學和基因型資料之間的關系。有趣的是，不同屬的菌落表現出不同的形态模式(圖3)。例如，Dorea、拟杆菌和Collinsella的菌落通常大而密，但表現出不同的圓形(Collinsella >拟杆菌> Dorea)，這反映了它們生長特性的差異。另一方面，糞腸杆菌的菌落更小更模糊，與本研究早期的結果一緻，它們的可培養性很差。此外，根據它們的系統發育，菌落形态顯著聚類。例如，通過基于形态學的排序，大多數梭菌屬彼此更接近。是以，菌落形态可能包含大量與分類身份相關的資訊。
圖3 使用菌落形态學預測分類學特性可增強靶向分離
細菌菌落可以通過物種間的互相作用影響其附近菌落的生長，例如競争營養物或交叉喂養必需的代謝物。以前的研究表明，相鄰細胞可以以可預測的方式嚴重影響菌落的大小。因為CAMII可以連續跟蹤菌落的動态生長，本研究系統地研究了瓊脂平闆上腸道分離物之間的共生長關聯。糞便樣本被鋪闆并成像，随後在第6天分離所有菌落，并用16S測序确定它們的分類身份(圖4)。對于每個ASV，瓊脂平闆上菌落的累積面積與它們在原始糞便樣品中的豐度相關，表明本研究的體外條件通常促進生長到與腸道中相同的程度。有趣的是，屬于糞大腸杆菌屬的菌落表現出較慢的初始生長，并且僅在附近有其他生長菌落存在時才開始出現。這一觀察表明，糞腸杆菌和其他物種之間可能存在共生或互惠的互相作用。為了更系統地研究CAMII實作的物種互相作用，本研究分析了群體形态、分類同一性和群體鄰域資料。本研究彙總了102071個視覺捕獲的集落(26997個分離的)的形态學資料和實體坐标，并評估了集落的生長是否受到鄰近細胞的影響。令人驚訝的是，本研究觀察到一些有趣的共生長模式，可能反映了種間的互相作用。例如，創傷拟青黴ASV-6的菌落大小與相鄰細胞的數量呈現負相關，這與創傷拟青黴和gut中的其他細菌之間存在由競争或拮抗作用介導的一般負互相作用的情況一緻。另一方面，糞大腸杆菌prausnitzii ASV-39與菌落動力學中較慢的初始生長相關的物種之一，它能夠生長出較大的菌落，具有與相鄰菌落的正相關性。
圖4 通過菌落形态分析腸道微生物群之間的互相作用
首先在本研究的分離物集合中探索人際菌株水準的基因組變異。與之前的報告一緻，同一個體中的大多數分離株具有非常少的基因組變異(即少于102個SNPs)，而人與人之間的分離株存在103-105個全基因組SNPs的差異(圖5)。有趣的是，觀察到同一物種的一些系統發育不同的分離物(即超過104個SNPs)在同一個人體内共存。例如，從H4個體中分離出兩種不同的P. vulgatus菌株，在H2個體中發現了兩種不同的B. uniformis菌株。本研究接下來試圖通過分析來自H1個體的408個分離的基因組來評估單個人内的菌株水準多樣性。因為腸道中豐富的物種預計會經曆更多的細胞分裂，本研究假設它們可能會在基因組中積累更多的SNP，假設腸道定植的持續時間大緻相同。事實上，每個分類單元内全基因組SNPs的數量通常與其在原始微生物組中的豐度相關。
圖5 個體内和個體間腸道微生物群的菌株水準基因組多樣性
2. 總結與展望
因為單個菌株是複雜群落中的行動機關，是以需要更完整的菌株收集。本研究提出的全面的生物庫可用于重建一個更全面的背景，可以同時考慮到整個群落的組成、種間互相作用和代謝能力，這将改善微生物功能、動力學和穩定性的研究。除了人類腸道，CAMII還可用于其他微生物組，如來自土壤、水生或農業環境的微生物組，包括噬菌體、真菌和原生動物的進一步分離和分析。機器人自動化系統還可以幫助生成系統菌株庫以及改進用于遺傳工程的易處理微生物底盤的篩選。
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