今天推送的文章是發表在Food Chemistry上的“
Improvement of stability and lipophilicity of pelargonidin-3-glucoside by enzymatic acylation with aliphatic dicarboxylic acid
”，通訊作者是浙江大學生物系統工程與食品科學學院的陳衛教授。
花青素是常見的天然色素，一些基于花青素的化合物已被歐盟、美國以及亞洲國家的立法準許用作天然色素添加劑。 天竺葵素-3-葡萄糖苷 (Pg3G) 是最具代表性的花青素之一，存在于草莓和覆盆子中。Pg3G的生物活性近年來備受關注。大量證據表明，Pg3G具有潛在的積極健康作用，包括抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖和抗炎。然而常見的花青素對pH、光照、熱處理敏感，并且脂溶性相對較低，這限制了它們在食品工業中的應用。
酰化花青素是花青素與有機酸發生酰化反應的産物。天然酰化花青素中涉及的酰基類型很多，包括脂肪酸（例如乙酸、蘋果酸和乳酸）和酚酸（例如沒食子酸、對香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）。大量研究證明，酰化花青素在穩定性和親油性方面優于非酰化花青素。是以，近年來開發了酶促酰化反應來獲得酰化花青素。這些研究大多采用Candida antarctica脂肪酶B(CALB)作為高效的催化劑，以脂肪酸為底物來獲得較高的酰化率。
脂肪族二羧酸（如草酸、丙二酸和琥珀酸）也參與了草莓、谷物和其他植物的花青素的酰化。脂肪族二羧酸酰化的花青素特有一個遊離羧基，形成兩性離子，可改善結構穩定性或生物活性。然而，脂肪酰基部分和糖之間的連接配接對無機酸很敏感，這在花青素的提取和分離過程中很常見。此外，脂肪族酰基部分的檢測和鑒定是複雜的，因為它們缺乏紫外/可見光吸收。是以，很難用二羧酸分離出足夠量的酰化花青素以供進一步研究。是以，很少有研究集中在脂肪族二羧酸衍生物的酰化花青素的性質。
在這項工作中，作者合成并鑒定了Pg3G-二羧酸衍生物并研究了Pg3G及其酰化衍生物的親脂性和熱穩定性，随後探索了酰化 Pg3G 衍生物的熱穩定性機制。
酰基供體和溶劑對酶促酰化反應的影響。花青素的酰化反應是一個可逆反應。在酰化反應過程中，酰基供體或溶劑對酰化反應的影響相對複雜。在本研究中，四種不同碳長的脂肪族二進制酸(草酸、丙二酸、琥珀酸和戊二酸)作為酰基供體，24 h後Pg3G的轉化率如圖1A所示。結果表明，轉化率與二進制酸的碳鍊長度呈正相關。當以草酸為反應物時，未發現産物。丙二酸、丁二酸和戊二酸的轉化率分别為6%~36%、60%~65%和70%~78%。如圖1B所示，初始反應速度與二進制酸的碳鍊長度相關，而反應在大約24小時達到平衡。在以前的研究中使用脂肪酸時也發現了類似的現象。二進制酸對酰化效率的影響可能歸因于其溶解性、疏水性和活性中心親和力。
圖1
溶劑不僅對反應物(酰基供體和花青素)的溶解性有關鍵影響，而且還影響與活性中心的互相作用，進而影響催化活性。在本研究中，三種常見的溶劑(乙腈、叔丁醇和叔戊醇)作為反應媒體。以丁二酸和戊二酸為原料時，三種溶劑的轉化率無明顯差異。然而，當以丙二酸為反應物時，叔丁醇(28%)和叔戊醇(35%)的轉化率顯著高于乙腈(6%)(圖1A)。是以，推薦叔丁醇和叔戊醇作為Pg3G與脂肪族二進制酸進行酰化反應的反應媒體。
Pg3G-二進制酸衍生物的鑒定。采用半制備高效液相色譜系統分離所需的Pg3G-二進制酸衍生物，并分别用LC-MS進行分析，分析表明酰化反應發生在糖苷部分。通過核磁共振研究進一步分析了Pg3G-二進制酸衍生物的結構。分析表明二進制酸與Pg3G的酰化反應發生在6’’-羟基。是以，初步的酰化産物鑒定為天竺葵素-3-(6’’-丙二酰基)葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6’’-琥珀酸基)葡萄糖苷和天竺葵素-3-(6’’-戊二酰基)葡萄糖苷。該結果還表明酶促酰化具有區域選擇性，這與之前的研究一緻，而脂肪酸被用作酰基供體。
表1
圖2
二進制酸酰化增強親脂性。為了确定Pg3G（1）及其酰化衍生物（2-4）的親脂性，采用辛醇-水配置設定系數法，結果如圖3所示。天竺葵素-3-(6’’-丙二酰基)葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6’’-琥珀酸基)葡萄糖苷和天竺葵素-3-(6’’-戊二酰基)葡萄糖苷的對數P值分别為−1.18、−0.93、−0.74和−0.54。由于産物中存在遊離羧基，與脂肪酸酰化相比，二羧酸酰化略微提高了花青素的親脂性。是以，通過添加二進制酸或脂肪酸的酶促酰化方法，可以在一定程度上提高花青素的親脂性。
二進制酸酰化提高了熱穩定性。花青素在酸性條件下是穩定的，但在中性條件下相對不穩定。根據表1，降解速率常數(k)随溫度升高而增大，半衰期(t1/2)随溫度升高而減小。Pg3G在37℃、50℃和60℃時的半衰期分别為7.45h、3.96h和1.83h。相比之下，所有酰化衍生物的t1/2值在各個溫度下都明顯較大。在熱降解過程中，Pg3G的Ea值(51.3kJ⋅mol−1)小于酰化産物的Ea值(53.0、69.3和69.7kJ⋅mol−1)。這一結果證明了二進制酸-酰化反應可以提高Pg3G的熱穩定性。此外，表1中的動力學參數表明，酰基的熱穩定性與碳鍊長度呈正相關。這種現象可能歸因于酰基的空間位阻，它影響花青素分子的水化并阻止降解。值得注意的是，Pg3G及其二羧酸酰化衍生物在強酸性條件下或中性條件下(圖3)表現出相似的顔色特征，盡管它們在熱穩定性上存在顯著差異。這一現象表明，脂肪族二進制酸-酰化反應對顔色特征的影響很小，是以，二進制酸介導的酰化花青素可作為pH顔色訓示劑的潛在應用。
圖3
花青素的多态。花青素在水溶液中産生一種依賴于pH的多種狀态，通常由flavylium cation (AH+), quinoidal base (A), hemiketal (B), cis-chalcone (Cc)和trans-chalcone(Ct)組成。這些物種通過幾個可逆反應共享一個互相關聯的平衡網絡。一般情況下，在強酸性條件下，AH+是優勢物種。但随着pH值的升高，AH+參與了不同的反應，并向其他物種轉化。
第一步是質子轉移形成A，在微秒内達到平衡。當pH≫pKa時，AH+立即完全轉化為A，吸收光譜發生紅移，最大吸收峰位于522nm。
第二步包括兩個反應：水合生成B，然後互變異構化形成Cc。水合作用是一個限速步驟，因為它比互變異構化慢得多。
最後一步是指Cc經過異構化反應生成Ct，并在幾小時内達到最終平衡。
Pg3G和Pg3G-二進制酸衍生物的摩爾分數分布。摩爾分數分布隻與氫離子濃度有關。PH<3時，AH+為主，pH>3時，以B和Cc為主(圖4)。此外，當pH上升到7以上時，A将失去一個質子并轉變為陰離子A−。然而，在強堿性條件下，花青素會自氧化并迅速降解。值得注意的是，在溫和的酸性或中性條件下，二羧酸的酰化反應改變了AH+, A, B, Cc和Ct的平衡分布。來自酰化衍生物的Ct的摩爾分數比Pg3G的低得多(圖4)。由于Ct的形成引發了花青素的降解，Ct的較少部分表明花青素具有較高的穩定性。這可能是酰化Pg3G衍生物在中性條件下表現出更好的熱穩定性的主要原因。該研究結果表明，二進制酸的酰化減少了不穩定的Ct的形成，這為研究酰化提高花青素穩定性的機制提供了一個新的視角。
圖4
綜上所述，天竺葵素-3-葡萄糖苷在6’’-羟基上被不同的二進制酸酰化，推薦叔丁醇和叔戊醇作為Pg3G與脂肪族二進制酸的酰化反應媒體，轉化率與二進制酸的碳鍊長度呈正相關。對三個初級酰化産物進行了純化和鑒定，證明了酶反應的區域選擇性。酰化Pg3G衍生物具有更好的親脂性和熱穩定性。基于對Pg3G及其酰化Pg3G衍生物摩爾分數分布的分析，推測在弱酸性或中性條件下，二羧酸酰化反應改變了flavylium cation (AH+), quinoidal base (A), hemiketal (B), cis-chalcone (Cc)和trans-chalcone(Ct)的平衡分布，進而使酰化Pg3G衍生物表現出比Pg3G更好的熱穩定性。總體而言，該研究為天竺葵素-3-葡萄糖苷與脂肪族二進制酸的酶促酰化反應後的穩定性和親脂性的改善提供了見解。
END
文章資訊：
PMID: 35500410
DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.133077