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你還在小瞧質譜嗎?

作者:伯遠生物

相信看過伯小遠往期文章的童鞋應該會發現,文章裡面有不少地方都出現了質譜的身影。但是,在過去的日子裡,小遠似乎還從未正兒八經地為大家介紹過質譜,但奈何質譜的光芒實在太過耀眼,是以這一期小遠打算将質譜正式介紹給大家!

質譜定義

質譜技術是建立在原子、分子電離以及離子光學理論基礎之上的應用技術,通過質譜分析可以獲得無機、有機和生物分子的分子量和分子結構,能對多種複雜混合物的各種成分進行定量或者定性分析。質譜技術其實就是高中實體課本上經典的“帶電粒子在磁場中的運動”問題的應用。簡單來說,就是把複雜的混合物放在質譜體系中,将其分解為原子、分子,然後将電離後的原子、分子注入到電磁場中。由于不同的帶電粒子的品質和電荷比例不同,偏轉時間也不同,質譜儀可以将這些時間、位置資訊轉換為光學資料,以質譜圖的形式展現出來,複雜混合物的各種組分就得以被直覺地觀察到。質譜圖的橫坐标是質荷比(m/z),縱坐标是離子強度。概念聽起來可能比較幹澀難懂,不過沒關系,我們今天主要講它的應用,看看它都可以幹些啥,原理後面再慢慢了解,也許就沒那麼難了!

蛋白質鑒定

在蛋白質組學中,蛋白質的鑒定幾乎完全是通過質譜來實作的,質譜可以鑒定任何已知基因組序列的蛋白質。另外,質譜分析方法最常見的是分析多肽而不是全長蛋白,并且很多時候會看到質譜與其它技術聯用來對蛋白進行鑒定!這麼說可能有點抽象,但是有一個實驗大家應該都有所耳聞——IP-MS(免疫沉澱-質譜聯用技術),在前面的多期文章中都有出現,為了加深大家對該技術的了解,伯小遠找了相關的實驗案例再次為大家進行講解。

在“Leucine-rich repeat extensin proteins regulate plant salt tolerance in Arabidopsis”一文中,作者為了研究LRX蛋白在生長調控和耐鹽性中的作用機制,使用35S::LRX3-YFP-HA、35S::LRX4-YFP-HA和35S::LRX5-YFP-HA轉基因植物進行了免疫沉澱-質譜(IP-MS)分析,以确定LRXs的潛在互相作用蛋白。同時以表達35S::GFP的轉基因植株作為對照。結果發現,在LRX轉基因植物的IP-MS樣本中鑒定出了4個系統發育相關的RALF多肽:RALF22、RALF23、RALF24和RALF31,但在對照樣本中沒有發現(圖1)。後面的實驗我想大部分小夥伴都已經知道是什麼了。沒錯!就是利用點對點驗證蛋白互作的方法對IP-MS鑒定得到的LRX的互作蛋白進行驗證,這個套路相信大家已經熟悉的不能再熟悉了,是以不清楚的小夥伴一定要記下來哦!

你還在小瞧質譜嗎?

圖1 在IP-MS檢測中鑒定出的LRX和RALF蛋白的多肽(Zhao et al., 2018)。從35S::LRX3-YFP-HA、35S::LRX4-YFP-HA和35S::LRX5-YFP-HA轉基因植株中提取蛋白。以過表達空載GFP的轉基因植株為對照。分離的蛋白與抗GFP抗體孵育過夜。用質譜法對免疫沉澱樣品進行分析。每個蛋白質所鑒定的多肽的數量被顯示出來,破折号“-”表示肽沒有被識别。

小遠叨叨:如果我們想要研究一個未知蛋白的互作蛋白是什麼,除了想到酵母雙雜篩庫的實驗之外,IP-MS也是我們應該想到的方法。IP-MS不僅能得到與酵母雙雜篩庫類似的結果,并且還具有以下優點:

1、IP-MS篩選的是天然狀态下的蛋白(沒有破壞蛋白的結構)互作,在一定程度上更能反應生物體内的真實情況;

2、不用像酵母雙雜篩庫那樣,擔心誘餌蛋白會存在自激活作用。

是以,以後在研究一個未知蛋白的互作蛋白時可以首先考慮IP-MS哦!

質譜定量分析

除了表型表達和蛋白質特性的初步鑒定外,蛋白質組學分析中的一個關鍵參數是對感興趣的蛋白質進行定量的能力。大約二十年前,蛋白質組學在很大程度上還是一門定性學科。典型的蛋白質組學實驗結果是在一個給定的組織或蛋白質複合物中鑒定出蛋白質的清單,而沒有任何關于豐度、分布或化學計量學的進一步資訊。相比之下,那個時候定量政策已被廣泛應用于微陣列或定量PCR的基因表達分析,特别是在植物中,大規模基因組學的測定為植物發育和生理的許多方面提供了新的見解。然而,酶的反應和信号通路最終取決于蛋白質的活性。蛋白質的數量受蛋白質合成和降解的調控,可能與轉錄調控沒有太大的關系(Piques et al., 2022)。此外,翻譯後修飾、異構體和剪接變異體不能僅通過分析轉錄本的豐度來擷取。是以,為了對一些生物學現象進行解釋,蛋白定量分析是必要的。質譜的出現為蛋白質組複雜性分析提供了技術架構。

定量蛋白質組學可以分為相對定量和絕對定量。相對定量旨在研究不同條件下蛋白質組表達的差異,而絕對定量是指獲得蛋白質的特異性表達水準。絕對定量需要使用标準化的參考樣品。小遠在下表中列出了一些常見的質譜定量方法,大家有興趣可以深入了解,這裡不做具體介紹哦!

表1 蛋白質定量組學不同工作流程的技術參數概述

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注:

1隻有通過與加标記的已知标準品進行相對比較,才能實作絕對定量。

2絕對定量隻能通過經驗特征和使用樣品中蛋白質的分子量和總蛋白品質的反計算來進行。

MS2:質譜法對肽離子破碎後産生的所有離子進行檢測。片段離子掃描也稱為MS2掃描或MS/MS掃描。

質譜法确定蛋白翻譯後修飾

翻譯後修飾(PTMs)是通過蛋白水解裂解或将修飾基團共價加到一個或多個氨基酸上而改變蛋白質性質的加工過程。僅僅根據豐度的變化來描述蛋白質的功能對了解蛋白質組是非常有限的,因為許多蛋白質的活性是由PTMs調節的,而PTMs可能不能準确地反映蛋白質豐度的變化。這就是為什麼許多用在蛋白質組範圍内表征和定量蛋白質和多肽的質譜技術已經被應用于表征翻譯後修飾的蛋白質的原因。

PTMs有多種類型,包括磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化等。質譜法被認為是蛋白質修飾分析的一個關鍵技術,因為它可以提供有關蛋白質修飾的通用資訊而無需先知道修飾位點的位置。自上而下,自中而上和自下而上的方法是基于MS的PTM分析的三種主要政策。

針對質譜蛋白定量與質譜确定翻譯蛋白翻譯後修飾,小遠先用一個例子給大家進行簡單說明,後期再對這部分内容進行詳細講解,因為該部分展開來講也是一個大工程啊!

栗子來了:

模式植物拟南芥不僅改變了我們對植物生物學的認識,還影響了生命科學的許多其他領域。來自拟南芥的研究結果也為作物的重要農藝性狀研究提供了思路。拟南芥的基因組在20年前被測序,自那以後,人們在基因組和表觀基因組水準上分析了數百種自然變異。相比之下,拟南芥蛋白質組作為大多數生命過程的主要執行者,其特征遠沒有那麼全面。為了解決這一差距,在“Mass-spectrometry-based draft of the Arabidopsis proteome”一文中,作者使用了最先進的質譜和RNA測序(RNA-seq)分析,獲得了我們所知的第一個拟南芥綜合蛋白質組、磷蛋白質組和轉錄組圖譜。這個豐富的分子資源可以用來探索單個蛋白質的功能或跨越幾個組學水準的整個途徑。

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圖2 組織圖和多組資料集(Mergner et al., 2020)。a. 分析的組織樣本示意圖,根據形态學分組着色(縮寫定義在b中):花(淺灰色);種子(深棕色);花粉(黃色);莖(深綠色);葉(淺綠色);根(深灰色);水果(淺棕色);愈傷組織(紅色);細胞培養(藍色)。b. 所有組織的蛋白質、P-位點和轉錄水準的識别數(n=1個測量值)。虛線表示在所有組織中檢測到的核心蛋白、P-位點或轉錄本的數量。組織增強的蛋白質或轉錄本用較深的顔色标記。具有高可信度氨基酸定位的P-位點(I類位點;大于0.75的定位機率)用粉色表示;模糊的位點定位用紫色表示。在一個組織中特異性檢測到的P-位點的數量用圓圈表示。c. 與Araport11相比,轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組資料集中鑒定出的基因位點總數和重疊部分(左),以及鑒定出的P-位點總數和I類位點的比例(右)。

通過這個例子可以看到,質譜不僅可以得到蛋白水準的定量資料,還可以鑒定磷酸化位點,得到磷酸化蛋白質組資料集。比起RNA-seq,質譜是不是要厲害的多,除了鑒定磷酸化,其它的蛋白翻譯後修飾也可以通過質譜進行鑒定,要想了解更多,請關注伯小遠後期的文章!

質譜與代謝

代謝組學是一個相對較新的研究領域,然而,自從1998年Oliver和他的合作者引入代謝組這個術語後,有關這一主題的出版物呈指數級增長。與動物相比,植物含有非常豐富的代謝物;植物中代謝物的總數估計在20萬或更多(K. Oksman-Caldentey and K. Saito, 2005)。正因如此,植物代謝組學在許多領域得到了廣泛的應用,如用于分類學或生物化學,目的基因或生态型指紋分析,突變體和轉基因植物與其野生型的比較,外部刺激對代謝産物譜的影響,植物與草食動物的互相作用、發育過程、藥材品質控制及藥用植物活性測定(Wolfender et al., 2013)等。由于植物代謝組學的應用是非常多樣化的,是以,用于分析植物代謝組學的技術也是多樣化的。聯用方法,如質譜與氣相色譜或液相色譜(GC-MS和LC-MS)、直接注射質譜(DIMS)、核磁共振(NMR)、毛細管電泳質譜(CE-MS)等。下面伯小遠要給大家介紹的是一種比較新的工作流程,該流程由2019年發表在The Plant Journal上的一篇題為“Comprehensive mass spectrometry-guided phenotyping of plant specialized metabolites reveals metabolic diversity in the cosmopolitan plant family Rhamnaceae”的文章中提出,文章介紹了該流程是一種可擴充的半自動化方法,通過整合幾種計算質譜/質譜資料分析方法來将植物代謝産物的多樣性和分布進行數字化展示。

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圖3 利用串聯質譜(MS/MS)對植物專用代謝物進行表型分析的資料分析工作流程(Kang et al., 2019)。利用串聯質譜進行光譜相似性分析,将相似的光譜聚類成分子族,形成一個分子網絡。網絡注釋傳播(NAP)為單個光譜提供了矽注釋候選。使用ClassyFire對這些候選分子進行化學分類,然後根據每個分子家族中最主要的化學類别對分子家族進行假定注釋。同時,利用MS2LDA分析了共發生片段和中性損失(Mass2Motifs)的分布,為其提供了樣品間亞結構多樣性和分布的資訊。

質譜成像

質譜成像(MSI)是一種基于質譜的分子離子成像技術。質譜可以從表面微米級大小的區域獲得,将化合物在表面(微電子學,組織切片)上的橫向分布轉換為圖像,進而與光學圖像相關聯。一些常見的電離技術包括DESI成像,MALDI成像和二次離子質譜成像(SIMS成像)。

MSI能夠對複雜表面的廣泛分子進行無标記檢測和定位,它已成為制藥和醫學研究中一個有吸引力的分子組織學工具。自2005年以來,MSI逐漸應用于植物研究(Imai et al., 2005;Mullen et al., 2005)。蛋白質和代謝産物的空間組織資訊将大大提高我們對植物代謝和特定植物組織生化功能的認識(Lee et al., 2012;Matros and Mock, 2013)。

MSI實驗的核心是質譜儀,它由離子源、質譜分析儀和探測器三大部分組成。在離子源中,分析物被解吸和電離;在分析儀中,它們根據品質電荷比(m/z)被分離;最後,分離的離子在探測器中被檢測到。作為最終輸出,通過在m/z刻度上顯示被檢測離子的強度來産生質譜。微探針MSI的基本原理很簡單:儀器通過對組織樣本的特定區域進行光栅化,收集一系列的質譜。随後,通過繪制分析物在質譜中的單個m/z峰與x-y坐标的強度,生成分析物在樣品表面的分布圖(Goodwin et al., 2008;Svatos, 2010)。MALDI成像實驗的典型工作流程如圖4所示。

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圖4 典型的MALDI成像實驗流程。

樣品處理是MSI中最關鍵的步驟,因為隻有适當的樣品制備才能保持分子的來源、分布和豐度,確定高品質的信号和足夠的空間分辨率(Grassl et al., 2011;Kaspar et al., 2011;Peukert et al., 2012;Spengler, 2014)。植物組織的MSI樣品制備方法比哺乳動物組織的更具挑戰性(Boughton et al., 2015;Heyman and Dubery, 2016)。高等植物體的角質層代表了内部代謝産物,是直接質譜成像的第一個障礙,因為大多數軟化技術(如MALDI和DESI)難以穿透它們(Thunig et al., 2011)。植物細胞壁是細胞内分子質譜成像的第二屏障。例如,當基質溶液噴到植物體表面時,細胞壁會阻止溶液在細胞壁上擴散,導緻MALDI成像中分析物提取效率降低(Takahashi et al., 2015)。植物組織中的高水分含量在冷凍切片過程中存在另一個挑戰。植物組織在冷凍時更為脆弱,此外,對于富含水分的植物樣本,也更難獲得完整的薄切片。在脫水過程中經常觀察到樣品收縮或部分剝落,這種現象通常會導緻表面不平整,進而影響MSI分析。需要注意的是,樣品的收縮也可能導緻MS圖像和光學圖像之間的不比對(Cha et al., 2008),使生物解釋變得困難。下面是關于質譜成像在植物研究中的應用舉例。

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圖5 角質層下代謝産物的質譜成像。(i)拟南芥葉片的MALDI成像。用鑷子夾住葉的左邊,中間不處理,右邊浸氯仿(b)。山奈酚(a)和山奈酚鼠李糖苷(d)在鉗夾和氯仿浸泡區容易檢測到,而在氯仿浸泡區C26(c)和C30(f)的脂肪酸被洗掉。未鑒定的分析物m/z=210(d)在氯仿浸漬區顯示出高豐度。(ii)大麥葉表皮m/z=276(b)、298(c)和300(d)的羟基丁腈苷的DESI圖像。葉背面表皮帶被剝落(a)。(iii)印迹成像與直接DESI成像的比較。(A)聚四氟乙烯上葉印的間接DESI成像。(B)直接DESI成像,以氯仿,甲醇和水(1:1:0.4,v/v/v)作為噴霧溶劑。(a)百脈根葉片的光學圖像。(a1)在聚四氟乙烯上的葉印記的光學圖像。(b-e)分别為m/z 104、286、298和300的DESI圖像。這些資料分别整合自(Cha et al., 2008)、(Li et al., 2011)、(Li et al., 2013)和(Bjarnholt et al., 2014)。

基于植物的MSI先前集中在方法論方面(Matros and Mock, 2013),而現在的技術已經成熟,是以它也被用于解決生物學重要的問題(Lee et al., 2012)。例如,在植物環境互動(Shroff et al., 2008,2015;Klein et al., 2015;Ryffel et al., 2015;Soares et al., 2015;Tata et al., 2015),新的化合物鑒定(Jaeger et al., 2013;Debois et al., 2014)和功能基因組學(Korte et al., 2012;Li et al., 2013)都有一定的應用。大家有興趣可以自己去了解哦!

小 結

通過以上幾個方面的介紹,小遠相信你對質譜應該有了一個大緻地了解,對于完全不了解質譜的人,看完今天的文章可能還會存在似懂非懂的情況,不懂也沒關系,隻要你知道質譜有哪些方面的應用,并且在以後做相關的實驗時能夠想到質譜,小遠就算沒白寫這篇文章啦!不管怎樣,質譜都隻是一個實驗工具,是服務于科研的,作為一個科研工作者你要做的就是如何利用好它,讓它發揮更大的價值哦!

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