近日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院甘海雲課題組、李楠課題組和梅奧醫學中心王志全團隊合作在Genomics, Proteomics & Bioinformatics雜志發表了題為“Defining Proximity Proteomics of Histone Modifications by Antibody-mediated Protein A-APEX2 Labeling”的文章，甘海雲研究員、李楠副研究員和王志全教授為共同通訊作者。李欣然、周嘉琦、趙文娟和文青為本文的共同第一作者。該項研究開發了一種可用于識别被修飾組蛋白周圍蛋白質的臨近标記新技術——AMAPEX (Antibody-mediated protein A- ascorbate peroxidase 2 labeling)。
（來源：文章首頁截圖）
許多生物過程是通過蛋白質和核酸的分子互相作用來執行和調節的，包括蛋白質-蛋白質互相作用、蛋白質-RNA互相作用和蛋白質-DNA互相作用。這些互相作用關系的失衡會導緻人類各種疾病的發生，如癌症、免疫失調和神經退行性疾病等。是以，研究細胞中這些分子間的互相作用的方法對了解人類疾病的生物學過程及其治療提供有利的工具。
傳統的親和純化和酵母雙雜交方法已被廣泛應用于發現潛在的分子互相作用。基于抗體的親和純化與基于質譜的蛋白質組學結合，可以富集和鑒定與特定蛋白質分子發生穩定互相作用的其他蛋白分子。這些技術的發展擴大了我們對各種系統中蛋白質互相作用網絡的了解。親和純化也可以結合交聯和核酸測序來鑒定蛋白與核酸間的互相作用，如染色質免疫沉澱測序(ChIP-seq)和RNA免疫沉澱測序(RIP-seq)。然而，親和純化的主要局限性是，在細胞裂解和随後的洗滌步驟中，往往會失去微弱或短暫的互相作用。為了克服這一點，親和純化可以與交聯相結合，但交聯後假陽性較高。此外，親和純化在應用于不溶性靶點或缺乏高親和抗體的蛋白誘餌方面具有挑戰性。酵母雙雜交和其他蛋白質互補實驗代表了另一種繪制活細胞中蛋白質間、蛋白質與RNA、蛋白質與DNA互相作用的方法。這些方法通常是高通量的，能夠篩選成千上萬個潛在的分子間互相作用。然而，許多蛋白質互補分析具有局限性，比如酵母雙雜交不能研究膜蛋白。
臨近标記技術(Proximity labeling，PL)的發展為傳統的在活細胞中研究分子間互相作用的方法提供了補充，該技術一般利用CRISPR基因編輯技術或基于質粒的表達将臨近生物素化酶與誘餌蛋白在細胞内融合表達。在添加外源生物素後，誘餌蛋白臨近的蛋白質會被生物素化，這些生物素化的蛋白質可以被鍊黴親和素偶聯的磁珠富集，之後可以通過質譜進行分析鑒定。目前最常用的臨近生物素化酶包括抗壞血酸過氧化物酶APEX/APEX2、辣根過氧化物酶HRP和生物素連接配接酶BioID、 BASU、TurboID、miniTurbo等。
工程化抗壞血酸過氧化物酶（APEX2）是由源自植物的抗壞血酸過氧化物酶經工程化改造而來。APEX2是一種非常快速的臨近标記過氧化物酶，它可以與生物素苯酚在H2O2的催化下生成生物素-苯氧自由基，這些自由基與富含電子的特定氨基酸（如Tyr、Trp、Cys和His）反應，使生物素被共價連接配接到蛋白質上。由于苯氧基的半衰期很短（
如上所述，盡管APEX2作為臨近标記酶有很大優勢，但是目前現有的研究方法依賴于基因編輯技術，需要将工程化酶在細胞内表達外源融合蛋白，這限制了其在難以轉染的細胞系、原代細胞、組織和病理樣品中的應用，且不能應用于翻譯後修飾的蛋白（例如組蛋白修飾）。為了解決這些限制條件，甘海雲課題組研究開發了一種由抗體介導的pA-APEX2臨近标記新技術 (AMAPEX)。該技術将Protein A與經過改造的抗壞血酸過氧化物酶APEX2結合形成pA-APEX2，通過特異性的抗體，将pA-APEX2靶向到被修飾的目标組蛋白。當細胞中存在底物生物素酚和過氧化氫時，APEX2可以把生物素标記到距目标蛋白半徑約20nm範圍内的所有臨近蛋白上。之後由于生物素與抗生物素蛋白鍊黴親和素（Streptavidin）之間的極強的親和力，可以利用鍊黴親和素磁珠将生物素标記的蛋白質純化出來，最後通過LC-MS/MS分析便可鑒定出目标蛋白周圍的蛋白質，進而研究哺乳動物細胞中蛋白質-蛋白質的互相作用關系。如圖1所示。
圖1 抗體介導的pA-APEX2臨近标記方法建構流程
通過質譜分析，該方法可精準鑒定出了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中組蛋白H3K27me3相關PRC1和PRC2亞基複合物，并與已有兩種方法的比較（BAC-GFP[1] 和 ChromID[2]），其鑒定範圍和準确度有較大提升。此外通過CO-IP驗證了NSD2與H3K27me3存在互相作用，證明了該方法的實用性（圖2）。
總體而言，AMAPEX 是一種非常有效的工具，我們可以通過它識别與修飾組蛋白相鄰的蛋白質，研究蛋白質間的互相作用，拓展對蛋白間互作網絡的認識，進而有助于我們探明由調控網絡紊亂造成的各種疾病的發生機理，進而為疾病治療奠定基礎。
圖2 利用AMAPEX方法鑒定組蛋白H3K27me3臨近蛋白質組
該工作中由甘海雲研究員團隊完成的研究得到了基金委國家重點研發計劃、國家自然科學基金重大專項、國家自然科學基金面上項目、廣東省合成基因組學重點實驗室、以及深圳合成生物學創新研究院的資助。
參考文獻
[1] Vermeulen M, Eberl HC, Matarese F, Marks H, Denissov S, Butter F, Lee KK, Olsen JV, Hyman AA, Stunnenberg HG et al (2010) Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell 142: 967-980
[2] Villasenor R, Pfaendler R, Ambrosi C, Butz S, Giuliani S, Bryan E, Sheahan TW, Gable AL, Schmolka N, Manzo M et al (2020) ChromID identifies the protein interactome at chromatin marks. Nat Biotechnol 38: 728-736