噬菌體等移動遺傳元件 (mobile genetic elements，MGEs) 進化出了抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR proteins，Acrs）抑制細菌CRISPR-Cas介導的适應性免疫系統。最近有報道指出，一些非噬菌體來源的Acrs，如AcrIIA17和AcrIIA18，可以通過調節sgRNA來抑制Cas9蛋白活性【1】，但其抑制機制尚不清楚。
2021年12月10日，天津醫科大學張恒教授課題組在Nucleic Acids Research雜志上發表了題為：Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA17 and AcrIIA18的文章，詳細闡釋了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas系統的機制。
CRISPR-Cas系統由成簇間隔短回文重複序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相關蛋白 (CRISPR-associated protein，Cas) 組成，是細菌和古細菌的适應性免疫系統，用于抵抗外來移動遺傳元件的入侵。CRISPR-Cas系統可以分為六種類型【2】，其中基于II型CRISPR-Cas9系統的基因編輯技術已被廣泛用于基礎研究和轉化應用。到目前為止，已經發現了二十多種靶向Cas9系統的Acrs蛋白，它們分别在不同階段以不同的方式抑制Cas9系統。其中一些主要通過結合Cas9并阻礙其發生必需的構象變化來抑制CRISPR-Cas9系統，例如，AcrIIA14、AcrIIC1和AcrIIC3結合 Cas9的HNH核酸酶結構域，使其處于無催化活性的構象。還有一些Acrs通過模仿PAM序列，結合Cas9，阻止底物DNA結合。與之前發現的II型Acrs不同，AcrIIA17-18大部分來源于非噬菌體，并通過調控sgRNA來抑制CRISPR-Cas系統【1】。
為了研究AcrIIA17的調控機制，作者使用AlphaFold2預測了AcrIIA17的結構，并通過DNA切割和EMSA等體外生化實驗驗證AcrIIA17與Cas9之間的互相作用，發現AcrIIA17與 NmeCas9的作用強于SpyCas9。利用pull down和ITC實驗，作者發現AcrIIA17通過與NmeCas9的橋狀螺旋 (BH) 結構域結合，抑制了Cas9-sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)複合物的組裝，最終抑制CRISPR-Cas9系統（圖一）。
為了研究AcrIIA18的抑制機制，作者首先通過X射線晶體學方法解析了AcrIIA18的高分辨率晶體結構。AcrIIA18包含一個N末端結構域 (N-terminal domain, NTD) 和一個C末端結構域 (C-terminal domain CTD)。由于暴露在溶劑中的帶電殘基可能參與底物結合和催化，作者在NTD和CTD結構域表面選擇了13個帶電殘基進行點突變和功能評估，發現NTD上的 V形口袋對AcrIIA18發揮抑制作用至關重要。通過體外RNA切割等一系列生化實驗，作者發現AcrIIA18可以将sgRNA的spacer區域切割至15nt，切割後的sgRNA不足以激活Cas9的内切酶活性，進而抑制CRISPR-Cas9系統（圖二）。
圖二
綜上所述，該研究從生物化學與結構生物學的角度闡釋了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas9系統的分子機制。AcrIIA17與 Cas9橋狀螺旋 (BH) 結構域結合，抑制Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)複合物的組裝；AcrIIA18通過切割sgRNA，抑制CRISPR-Cas系統。該研究結果不僅為II型Acrs抑制CRISPR-Cas9系統的機制提供了新的見解，并且可能為開發CRISPR-Cas9系統調控工具提供理論依據。
天津醫科大學基礎醫學院張恒教授和銀行博士為本文共同通訊作者，2021級博士生王枭燊和李徐梓超為本文的共同第一作者。
原文連結：
https://doi.org/10.1093/nar/gkab1197
制版人：十一
參考文獻
1. Mahendra, C., Christie, K.A., Osuna, B.A., Pinilla-Redondo, R., Kleinstiver, B.P. and Bondy-Denomy, J. (2020) Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer. Nature microbiology, 5, 620-629.
2. Mohanraju, P., Makarova, K.S., Zetsche, B., Zhang, F., Koonin, E.V. and Van der Oost, J. (2016) Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science, 353.
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