今日推送的文章是发表在Journal of Biological Chemistry上的“Functional domains of a ribosome arresting peptide are affected by surrounding nonconserved residues ”，通讯作者为美国阿拉巴马州亨茨维尔亨茨维尔阿拉巴马大学的Heather N. G. Judd。
负责 L-色氨酸 (L-Trp) 转运和分解代谢的大肠杆菌 tnaCAB 操纵子的表达受到 L-Trp 指导的翻译阻滞和核糖体阻滞肽 TnaC 的调节。TnaC 的功能依赖于分布在整个肽中的保守残基，这些残基参与在核糖体出口通道处形成 L-Trp 结合位点并抑制核糖体功能。本文目的是了解这些关键保守残基周围的非保守氨基酸是否在 TnaC 介导的核糖体停滞中发挥功能作用。
作者研究了两种基因内突变的影响，这些突变部分恢复了 TnaC RAP 的 LOF 突变体中 L-Trp 依赖性诱导（表 1 和 2）。使用连接的报告基因构建体P24突变（表2）；而 R23H 可以部分抑制几乎所有在 D16、W12 和 P24 位点测试的 LOF 突变，W12A 除外（表 2）。作者表明，新生的 TnaC(S10P) 肽在比 WT TnaC 肽更低的 L-Trp 浓度下诱导核糖体阻滞的积累（图 3），并且与 R23F 相比，S10P 对作用没有一般影响。体外的嘌呤霉素，但相反增加了 L-Trp 阻断嘌呤霉素的能力（图 4）。此外，含有 S10P 的新生 TnaC 肽不会以 TnaC(R23F) 肽的方式影响 TnaC 阻滞核糖体复合物中 PTC 的活性。并且佐证了TnaC 肽诱导核糖体停滞需要两个不同的结构域，称为传感器和失速结构域，其中 S10P 影响传感器结构域，R23F 影响失速结构域（图 5） 。用于在通道内结合游离 L-Trp 的传感器结构域包含保守的 TnaC 残基 W12 和 D16，并且在较小程度上包含邻近的不太保守的残基。停滞结构域由 P24 和邻近残基（例如 R23）构成，作用于 PTC，以降低活性分子（例如嘌呤霉素和 RF2）在核糖体活性位点的结合动力学。
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已鉴定出三种 TnaC 突变 S10P、R23H 和 R23F，可增加 TnaC 对 L-Trp 的敏感性。R23F 首次在 TnaC 肽中被发现，它可以在延伸阶段阻止核糖体，而 S10P 和 R23H 突变作为这项工作的一部分被分离出来，作为抑制突变，恢复非诱导性 D16E 肽的诱导。R23F 突变产生稳定的核糖体阻滞复合物，用于获得由 L-Trp 结合的 TnaC 阻滞核糖体的高分辨率 2.4 Å 冷冻电镜模型。R23 TnaC 残基的变化降低了 TnaC 对嘌呤霉素转移的敏感性，与 L-Trp 无关（图 4D）。由于R23氨基酸残基靠近PTC，作者预计该位置的变化可以降低嘌呤霉素和RF2在PTC上的作用动力学，从而使TnaC-核糖体复合物能够以更高的效率与L-Trp相互作用（图1）。这可以解释 R23H 对 LOF P24C 突变的抑制作用（表 2）。正如之前提出的，作者认为 R23 位置上存在的 His 或 Phe 残基与 PTC A 位点 中 RF2 的 Q252 残基发生冲突，并降低了 RF2 的适应率。然而，不能排除 R23H/P24C 双突变也可能影响 Rho 结合的可能性，如之前所建议的。
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当前的 TnaC-核糖体结构显示 L-Trp 结合位点附近的 S10 残基正好超出收缩区域。因此，与 R23F/H 的变化相比，S10P 残基的变化不太可能在物理上阻碍 A 位分子的适当调节，因此必须以不同的方式发挥其作用力。作者已经证明，S10P 增加了 L-Trp 敏感性，而不影响 PTC（图 4），并假设 TnaC 第 10 位上 Pro 残基的存在增加了 L-Trp 结合位点的亲和力。根据使用 2.4 Å 冷冻电镜结构获得的密度图，未观察到 S10 残基与游离 L-Trp、uL22 蛋白或 23S rRNA 核苷酸之间的相互作用。此外，S10 不是 TnaC 肽家族中的保守残基。然而，使用 N 端截短的 TnaC 肽进行的实验表明，W12 残基之前应至少有两个残基以维持功能性肽。这一观察结果表明，W12 依赖于 S10 残基在核糖体出口通道内的空间分布，并且该位置的脯氨酸残基可能会增加 W12 建立功能构象的机会（图 5）。用小氨基酸（例如 Ala）替换 W12 残基会降低 S10P 抑制 LOF 表型的能力（表 2），表明结合 L-Trp 的亲和力增加取决于第 12 个残基的大小。作者认为，这表明，如冷冻电镜所观察到的，能够容纳游离 LTrp 的结合位点的形成需要 TnaC 12 位上的长链或庞大的氨基酸残基。此外，一旦 TnaC 与游离 L-Trp 相互作用，TnaC 第 12 位的大氨基酸也可能有利于通过 TnaC 肽向 PTC 传输结构信息。这些最后的想法得到了 R23H 变化观察到的抑制活性缺乏的支持。W12A 突变（表 2）。也就是说，尽管 R23H 突变会降低 PTC 的活性，但 TnaC(R23H) 肽仍必须依赖游离 L-Trp 的结合来获得最大的阻滞能力（图 5）。
与 W12 变化获得的结果相反，数据表明 D16 位点的长链氨基酸残基（例如 Lys）阻碍了 S10P 或 R23H 突变抑制 LOF 表型的能力（表 2）。D16 残基与 U2609 23S rRNA 核苷酸残基在肽出口通道处相互作用，对于 tna 操纵子的 L-Trp 诱导很重要。D16 位于 TnaC 肽的两个 α 螺旋之间的区域，形成 110° 铰链，允许形成 TnaC 阻滞构型。D16 对于其他 WT TnaC 肽的作用很重要（表 2）。然而，当 TnaC 肽含有 S10P 或 R23H 时，第 16 位的残基同一性变得不太重要，因为除 Asp 之外的小残基（例如 Ala）允许 TnaC（S10P 或 R23H）发挥功能（表 2）。第 16 位的小尺寸 Ala 残基可作为肽内的占位符，用于正确定位包含在传感器或失速功能域中的通道的必需 rRNA 残基。S10P 和 R23H 产生的 TnaC 肽的结构变化可能会将出口通道内 D16 残基的位置移动到更接近 23S rRNA 残基。用小氨基酸残基取代 TnaC 的 16 位可能仍有助于形成 TnaC 阻滞构型所需的铰链。
这里介绍的工作展示了如何利用非保守残基的突变来调节 RAP 的反应性。S10P 和 R23H 这两个突变都增加了 TnaC 检测 L-Trp 的敏感性，并部分抑制了与一些（但不是全部）废除 L-Trp 诱导的突变相关的 LOF 表型。作者认为 S10P 和 R23H 抑制因子都会改变 TnaC 肽的整体结构，从而消除了折叠成功能构型所需的必需残基的必要性。这些数据支持这样的观点：非保守残基也可以显着调节该抑制肽的功能。作者对 TnaC 肽变体诱导核糖体停滞的多功能性的观察表明，来自不同细菌的调节性停滞肽的序列已被进化选择，以根据环境中的 L-Trp 水平调整 tna 操纵子的表达。未来的生化和结构研究可能会确定来自其他细菌菌株的 TnaC 调节的 tna 操纵子是否对特定的 L-Trp 浓度做出反应，以及这些 TnaC 肽变体是否可以感知其他代谢物，这可能会阐明如何合理设计。