近日，中国农业科学院作物科学研究所刘录祥研究员团队构建了以六倍体普通小麦骨干亲本京411为背景的全外显子大容量突变体库，阐明了不同诱变因素变异特征；利用正向和反向遗传学的方法，揭示了该突变体库在功能基因组研究的应用。相关研究成果在线发表在植物学知名期刊《Plant Biotechnology Journal》上。
全基因组或全外显子测序突变体库为作物功能基因研究提供重要材料基础。小麦基因组庞大，组装注释的中国春小麦2.1版参考基因组共约14.4Gb，包含106913个高置信度基因和159840低置信度基因。尽管小麦外显子测序突变体库已有报道，构建高容量、涵盖更多基因变异的突变体库对于小麦功能基因组研究非常必要。
该团队利用EMS、高能碳离子和γ射线等不同诱变方式创制了2162份小麦突变体，包括1719份M2代以及443份遗传稳定的高代突变体（图1）。通过外显子捕获测序M2或高代稳定突变体单株，利用三代测序技术组装野生型京411基因组并结合重测序数据，对突变位点进行校正，共鉴定到18,025,209个突变位点，有效突变覆盖96.7%的高置信度基因和70.5%低置信度基因，每kb的CDS区平均检测到47.1个突变。PCR测序验证结果表明，EMS类型SNP突变位点阳性率为94.5%，非EMS类型SNP突变位点阳性率为87.9%，InDel阳性率为81.4%；缺失位点扩增验证表明79.1%的大片段缺失为阳性。
图1. 小麦外显子突变体库构建流程与部分表型。
研究比较了EMS、高能碳离子和γ射线诱变的序列变异特征（图2）。研究结果表明高能碳离子和γ射线比EMS诱导更丰富的氨基酸变异，并且能够产生较多的小片段以及大片段缺失。γ射线诱导的大于1Mb的大片段缺失总体上多于碳离子，高能碳离子和γ射线诱导突变位点在染色体上呈现不均匀分布。
图2. 不同诱变方式分子变异特征比较。
利用正向和反向遗传学案例阐明了该突变体库在小麦功能基因研究中的应用（图3）。以M3代分离群体为材料，通过一个性状分离的黄绿叶突变体yg1，利用13个M3代单株外显子捕获测序，结合基因型和M4代表型分离情况，将黄绿叶基因定位在2D染色体2.8Mb区间。该方法省去周期较长的杂交构建遗传分离群体的过程，能够快速高效获得目标性状基因区段或候选基因。利用反向遗传学手段，对突变体库中赤霉素合成及信号转导突变基因的株高表型进行分析，这些基因功能区突变后均对株高表型产生了影响，尤其是GA20ox2基因突变后株高降低较明显。
图3. 正向和反向遗传学案例阐明突变体库在小麦功能基因研究中的应用。
利用该外显子突变体搭建了基因突变位点检索网站：http://jing411.molbreeding.com/#/。自2022年6月开始已经在国内外公开使用。
中国农业科学院作物科学研究所熊宏春副研究员和郭会君研究员为该论文的共同第一作者，刘录祥研究员为通讯作者。中科院近代物理研究所周利斌研究员和成都天成未来公司陈中旭博士参与了此项研究。本研究得到国家重点研发计划项目（2022YFD1200700）、现代农业产业技术体系（CARS-03）和中国农科院科技创新工程等项目的资助。
原文链接：http://doi.org/10.1111/pbi.14111
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