今天推送的文章发表在Food Chemistry上的“Purification and characterization of the enzymes from Brevundimonas naejangsanensis that degrade ochratoxin A and B”，作者为中国农业大学的梁志宏副教授。
霉菌毒素是次级代谢产物，主要由曲霉属、青霉属和镰刀菌属的某些物种产生。它们广泛污染食品和饲料，对人类和动物具有剧毒，给全球农业造成巨大的经济损失。赭曲霉毒素(OTs)是重要的霉菌毒素类别之一。已发现20多种OTs，其中赭曲霉毒素A(OTA)是在农产品中检测到的主要赭曲霉毒素。多种OTs通常在食物中同时存在，发现OTA和赭曲霉毒素B(OTB)在小麦、红酒和干果中被共同污染。OTA对动物具有肾毒性、肝毒性、免疫毒性和致癌性，被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。与OTA相比，OTB的毒理学研究较少。OTB的毒性低于OTA。细胞系研究发现，OTB具有潜在的免疫毒性和致畸性。
霉菌毒素的解毒策略通常包括物理、化学和生物方法。生物解毒，简而言之，就是利用微生物或酶来降解毒素，具有高效、专一性强、不破坏营养物质等特点。降解OTA的微生物多种多样。虽然已经发现了丰富的降解OTA的微生物资源，但大部分降解酶基因还没有被挖掘出来。只有少数羧肽酶和酰胺酶在微生物中降解OTA。这些降解基因的发现对于OTA的生物解毒具有很大的应用前景。降解OTA的酶主要包括两类，即羧肽酶和酰胺酶。源自牛的羧肽酶A(CPA)是第一种被发现可水解OTA的酶。然后还发现羧肽酶B(CPB)和羧肽酶Y（CPY）可以降解OTA。另一组重要的OTA降解酶是酰胺酶，首先在A.niger中发现。Dobritzsch等从A.niger的商业脂肪酶A中纯化了一种OTA降解酰胺酶，在60分钟内降解率为50%(50 ng/mL)。在Alc.faecalis和Stenotrophomonas acidaminiphila中也发现了降解OTA的酰胺酶。这些酶对OTA的降解机制是水解OTA的酰胺键生成OTα和苯丙氨酸。
作者团队之前获得了具有OTA和OTB降解能力的Brevundimonas naejangsanensis菌株ML17。本研究的目的是从该菌株中提取OTA和OTB解毒酶。通过(NH4)2SO4盐析、疏水相互作用层析(HIC)和高分辨率透明天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(hrCNE)连续纯化了OTA降解酶。活性组分中的酶通过LC-MS/MS鉴定。然后将潜在降解酶的基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中重组表达，以验证OTA和OTB降解功能。最后，在人胚肾细胞系(HEK293)中评估了OTA和OTB降解产物的细胞毒性。本研究发现了四种新型OTA降解酶，可将OTA和OTB降解为低毒产物，为赭曲霉毒素的生物解毒提供基础研究内容。
用(NH4)2SO4盐析纯化
用(NH4)2SO4盐析蛋白质大大减少了溶液体积，同时保留了蛋白质的生物活性，因此常用于蛋白质纯化的第一步。首先通过盐析法提取ML17菌株胞外代谢物中的OTA降解酶。饱和度为20%、40%、60%和80%的(NH4)2SO4盐析的蛋白质具有OTA降解活性（图1）。主要的降解酶可以用80%饱和度的(NH4)2SO4盐析。为了获得更多的活性成分，后续的纯化工作使用饱和度为80%的(NH4)2SO4来浓缩OTA降解酶。该步骤将粗酶的体积减少了约16倍，降解酶被纯化了5.1倍，产率为18.9%。
HIC纯化
HIC在特定条件下根据疏水系数分离不同的蛋白质。大多数蛋白质在高离子浓度下被HIC的疏水配体吸附，并在低离子溶液中洗脱。第二步纯化是使用HIC纯化OTA降解酶。如图2A和B所示，OTA降解酶集中在100 mmol/L (NH4)2SO4的洗脱峰。不同洗脱组分的蛋白质差异很大，表明它们分离良好（图2C）。3-7的组分具有最强的OTA降解活性，并在50和70 kDa左右共享相同的条带，这可能是OTA降解酶（图2B和C）。HIC纯化步骤将粗酶溶液的体积减少了约3.4倍，纯化倍数为7.2，产率为9.2%。
两次hrCNE纯化
hrCNE根据蛋白质的电荷和分子量分离蛋白质，同时保留蛋白质的生物活性。接下来的纯化步骤是使用两次hrCNE来纯化OTA降解酶。在第1次hrCNE时，将标记泳道和其中一个样品泳道的凝胶切下并染色以供观察（图3A）。蛋白质在hrCNE的凝胶中得到很好的分离。然后将样品的凝胶从上到下切成6等份，电泳洗脱回收凝胶中的蛋白质。如图3B和C所示，从第1次三个凝胶中回收的蛋白质具有OTA降解活性，并且这些组分在440 kDa标记周围有共同的条带，这可能是OTA降解酶的位置。从第一次hrCNE的条带2中回收的蛋白质进行第二次hrCNE。与第一次hrCNE类似，将第二次hrCNE的凝胶分成5等份，然后回收蛋白质。从第2次hrCNE的条带1和2回收的蛋白质具有更好的OTA降解活性（图3F）。hrCNE(图3D)和SDS-PAGE(图3E)的电泳图可以发现，经过第2次hrCNE后，降解酶成分比较纯。
从第2次hrCNE的条带1和2中回收的蛋白质通过质谱法鉴定。回收蛋白中存在四种潜在的OTA降解酶，分别属于M3家族肽酶、丝氨酸羧肽酶、M14金属肽酶和酰胺水解酶家族蛋白。这四种酶分别命名为BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3和BnOTAase4，分子量分别为79.7、58.4、67.7和45.8 kDa。这四种酶的氨基酸序列与报道的OTA降解酶进行了BLAST比对，其中包括来自牛、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和溶杆菌的羧肽酶，以及来自黑曲霉、粪产碱菌和窄养单胞菌属的酰胺酶。四种酶的氨基酸序列与发现的OTA降解酶的同一性均低于25%，表明这些酶是新型潜在的OTA降解酶。
降解酶的重组表达
四种潜在的OTA降解酶的基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达，以验证它们的OTA和OTB降解活性。如图4所示，SDS-PAGE（图4A）和Westernblot（图4B）检测到目的基因表达成功。BnOTAase1、BnOTAase2和BnOTAase3主要在细胞中可溶性表达。BnOTAase4在细胞内可溶性和包涵体中均有表达。这些酶通过镍亲和层析纯化，获得具有近似理论分子量的产物（图4C）。
重组酶的OTA和OTB降解活性
通过HPLC确定重组酶BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3和BnOTAase4对OTA和OTB的降解率。OTA、OTα、OTB和OTβ标准品的保留时间(RT)分别为4.270、3.427、3.443和2.899分钟（图5A和B）。在重组酶与OTA或OTB的反应体系中，检测各自的产物，其色谱图与标准品相似或相同。这四种重组酶分别将OTA和OTB降解为OTα和OTβ，降解率为100%。重组酶水解的OTA和OTB降解产物的RT与CPA相同，说明重组酶和CPA具有与OTA和OTB相似的降解机制，即水解OTA和OTB的酰胺键（图5B)。
用于水解OTA或OTB的重组酶的米氏常数Km通过双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图)确定。以OTA为底物，BnOTAase1、BnOTAase2、BnOTAase3和BnOTAase4的Km值分别为19.38、0.92、12.11、1.09 μmol/L。以OTB为底物时，这4种重组酶的Km值分别为0.76、2.43、0.60和0.64 μmol/L。
OTA和OTB降解产物的细胞毒性
为了确定OTA和OTB的降解产物（OTα和OTβ）的毒性是否减轻，本研究检测了OTA、OTB及其降解产物对HEK293细胞系诱导的细胞增殖毒性、凋亡率和细胞周期停滞效应。暴露于OTA和/或OTB(0–30 μmol/L)会导致细胞活力呈浓度依赖性降低，并且它们的降解产物在试验浓度范围内对HEK293细胞系没有增殖毒性（图6A）。培养基对照（CK）、OTA、OTB、OTA和OTB联合处理组细胞凋亡率分别为4.21±0.06%、20.66±0.50%、17.44±0.21%、20.14±0.06%（图6B）。降解产物处理组对细胞凋亡率没有显着影响（p大于0.05）。OTA和OTB的联合处理显着改变了细胞周期。G0/G1期细胞比例下降至对照组的77.08%，S期和G2/M期细胞比例分别增加1.15倍和3.48倍，提示细胞周期停滞在S期和G2/M期（图6C）。降解产物处理组没有显着改变HEK293的细胞周期进程。上述结果表明OTA和OTB的降解产物对HEK293细胞系的毒性较小。
DOI：10.1016/j.foodchem.2023.135926
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135926