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CPMG实验通过记录GS的效应横向弛豫速率R2,eff随着一系列施加上去的化学位移重归位的射频脉冲的频率CPMG而产生的

作者:道尔顿笔记

CPMG实验通过记录GS的效应横向弛豫速率R2,eff随着一系列施加上去的化学位移重归位的射频脉冲的频率CPMG而产生的变化,得到弛豫弥散图谱。

R2,eff的值是从随射频脉冲频率变化的基态的峰强度关系得来的。越密集的RF脉冲越能够有效地抑制由于化学交换所产生的散相,得到的谱峰就越窄,R2,eff的值就越小。

对于R1ρ来说,起始的磁化向量是沿着效应场方向的,这个相应场是一个连续的射频弱脉冲SL和offset的合场。这个连续的弱脉冲是被用来将磁化向量锁在效应场方向的,所以被称为“spin-lock”(SL)。

其原理和CPMG异曲同工,都是通过RF脉冲场来调制基态共振由于化学交换产生的散相,从而改变峰展宽的。CPMG是通过调节180°重归位脉冲实现的,而R1ρ实验则是通过施加一个弱的连续RF脉冲,从而使得GS和ES下的效应场靠近从而降低由于在GS和ES之间来回交换造成的散相来实现的。

这样一来,通过弛豫弥散实验得到的Rex随着施加的RF变化(对于R1ρ来说还有)的关系,就可以拟合得出化学交换的热动力学参数,比如ES的丰度Ep、交换的速率exk以及GS和ES的化学位移差。

CPMG实验(Leblancetal.,2018;Marusicetal.,2019)记录一系列不同CPMG频率下的图谱,然后用提出来的R2,eff画图。在不同强度的B0场下能够提取出ES的化学位移,从而可以用来预测ES的结构。

R1ρ实验(Dethoffetal.,2012b;Marusicetal.,2019)记录一系列不同spin-lock轻度或是offset下的GS化学位移图谱,可以得到R1ρ。ES的化学位移可以从非共振的曲线中得到,然后可以根据结构特征进行分析。

CPMG通常用于exk在200s-1到2000s-1,Ep≥1%的情况,而R1ρ实验比之要广一些(60s-1到6000s-1)。对于20s-1到300s-1的情况,CEST(化学饱和转移)实验也是一个选择。CEST是基于化学饱和的转移的原理来得到瞬态的信息的。

在CEST实验里,也需要在特定的核所对应的化学位移范围内施加一个弱的连续的射频脉冲,被施加脉冲的共振会达到饱和,从而丢失信号,显示在一个正常的二维谱里就是谱峰强度降低。当这个弱场施加在GS共振时,表现为GS的谱峰强度出现大幅度的降低,而当弱场施加在“看不见”的ES共振时,ES的饱和效应会由于化学交换传递给GS,表现为GS的谱峰出现稍小一些的降低。通过这种方式,拟合GS的谱峰相对于未施加弱场之前的强度比随弱场化学位移位置变化关系就可以得到ES的信息。

CEST实验(Marusicetal.,2019;Zhaoetal.,2013)拟合不同饱和offset下的峰的经过归一化的强度,ES的化学位移就可以提取出来。对于得到的CEST图谱来说,大的凹陷对应的是GS的化学位移位置,如果存在ES,将会出现小的凹陷。

为了获得ES的二级结构,可以先通过弛豫弥散实验得到,与GS的化学位移相加就可得到ES的化学位移。之前的工作通过利用15NR1ρ的弛豫弥散方法,捕捉到了P5abc在没有镁离子条件下存在一个快速切换的二级结构开关(Xueetal.,2016)。

除了15NR1ρ的弛豫弥散,CEST也被运用于检测15N弛豫弥散信号(Vallurupallietal.,2012)。但是,只用15N作为探针,并不能完全印证这种切换模式,或是说这种切换的一些细节并不能得到完全的确认,因为可能会出现不同的切换模式在15N方向上的跳变是接近的,这样就造成了确认二级切换模式确认的模糊性。

GG的非经典配对,但是却不能排除它们之间没有形成任何配对的可能。例如,只通过15N的数据,可以猜测P5abcES里164号和176号的残基可能形成如果能够同时测量质子的弛豫弥散实验来获得ES的化学位移,就能够排除这种模糊性。

同时,质子是用来测量弛豫弥散的一个强有力的探针,因为它可以承受更高的spin-lock强度,且具有更宽的分布范围,因此可以被用来探测到更快速的交换里的,更低丰度的ES。当亚氨基质子被运用于测量RNA的弛豫弥散时,它的优势则更明显,因为它具有大约5ppm之广的分布范围,也就是它的信号会较N强很多,同时因为在1HN方向上,不同配对类型的分布区域几乎没有重叠,因此,它能清晰直观地指示碱基配对类型。

因此,如果将15N和1H作为探针的弛豫弥散实验都用于捕捉ES的二级结构的话,会是一个质的提升。

CPMG实验通过记录GS的效应横向弛豫速率R2,eff随着一系列施加上去的化学位移重归位的射频脉冲的频率CPMG而产生的
CPMG实验通过记录GS的效应横向弛豫速率R2,eff随着一系列施加上去的化学位移重归位的射频脉冲的频率CPMG而产生的
CPMG实验通过记录GS的效应横向弛豫速率R2,eff随着一系列施加上去的化学位移重归位的射频脉冲的频率CPMG而产生的

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