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- 如果您本来就打算要做外泌体功能学研究，您继续看本篇精华小贴，图文并茂啊，啧啧~~~(原谅小编如此的Thick-skinned)。
PS:①必须郑重声明，这只是恩博家的部分功能学实验结果展示；②本篇精华小贴中EV/EVs均指外泌体
1、外泌体量产
正常细胞贴壁培养时受到贴壁抑制，需要进行传代处理，因此上清液中收集的外泌体数量有限。通过微载体培养细胞，使细胞附着于微载体上，同时又能够进行类似悬浮培养的方式，在反应器中不断增殖并分泌出大量外泌体，提高上清液中外泌体的含量。为了实现这一目的，应用UniTantris的微载体不同操作方式动态培养贴壁细胞，测试细胞数量及外泌体产量。
选择已适应无血清培养体系的MCF-7细胞为测试对象。初始细胞数量均为7 x106，分别进行正常贴壁培养，分别应用微载体采用3种培养条件进行动态培养1周，分别在0d、3d、7d进行细胞计数，在第7天，收集上清(300ml左右)，分离外泌体均定容至500ul，BCA定量，结果如下。
图1、各处理组外泌体产量
图2、单位细胞外泌体产量/相对产量
2、外泌体改造
外泌体临床转化中的重要环节之一是将具有调控功能的核酸导入细胞分泌的外泌体中，为了实现这一目的，以外源性核酸RNA-80为例电穿孔导入293细胞产生的外泌体中，并洗涤纯化后，NTA测外泌体粒径及浓度，qRT-PCR检测外源性核酸RNA-80及内参ACTB(Beta-actin)的CT值。
图3、电穿孔前后NTA分析结果
本次实验利用293细胞EVs进行电穿孔和后续检测实验，证实电穿孔成功。通过NTA粒径分析和ACTB(Beta-actin)的CT值数据可以看出，电穿孔后囊泡数量会减少约30-50%，可能是由于电穿孔过程中的囊泡融合或正常实验损耗。
图4 电穿孔稳定性检测结果
3、受体细胞对外泌体的摄取
如果要证明受体细胞所分泌的外泌体，可以作用于特定的受体细胞，即被受体细胞内化吸收，少不了外泌体示踪实验。PKH-26/ DIL(red)亲脂性染料，可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，外泌体标记荧光染料，洗涤后，加到细胞中孵育，共聚焦下观测细胞内化情况。12小时明显看到DAPI标记的细胞内出现红色荧光标记的外泌体。
4、细胞表型
受体细胞吸收外泌体后，哪些表型发生了变化？阅文无数的你，看过十八般“武艺”的你，一想到细胞表型，是否也张口就来：细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭等。当然不同疾病系统观测的表型也会有一定的特殊性，不着急，恩博后续还会继续分享。
CCK8检测细胞增殖实验
CCK-8是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的结晶。细胞增殖越多越快，则颜色越深。取对数生长期的SW480细胞每孔7000个种到96孔板中，贴壁后加入药物(/外泌体或其他)处理，24小时后用CCK8试剂盒检测细胞活力。
注：横坐标为药物浓度，纵坐标为细胞活性。
流式细胞仪检测细胞凋亡
在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧与Annexin V结合，因此以标记了的Annexin V 作为荧光探针(Annexin V-FITC)，利用流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。取对数生长期的SW480细胞每孔 1×105个种到6孔板中, 贴壁后加入药物(或外泌体)等处理，48小时后，收集细胞进行染色然后流式分析。
注：CPX对细胞有潜在细胞毒性，可诱导细胞凋亡。纵坐标为PI染色标记的凋亡中晚期和坏死细胞，横坐标Annexin V荧光，标记早期凋亡细胞，右下象限即为凋亡细胞。
流式细胞仪检测细胞周期
根据细胞周期过程中DNA含量变化，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么S期细胞的荧光强度为1-2之间，G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2。细胞内的DNA被碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。取对数生长期的293T细胞以 3-5×105个种到10cm皿中, 贴壁后加入药物(/外泌体等)处理，24小时后收集细胞进行固定染色然后流式分析。
注：左图横坐标为胞内DNA PI染色，纵坐标为细胞计数；右图纵坐标为DMSO和对照NC组处于各细胞周期阶段的细胞计数比例。结果表明，DMSO处理后产生G2/M期阻滞(表现为G2/M期细胞增多)。
细胞迁移Transwell实验
肿瘤细胞的迁移和侵袭是恶性肿瘤细胞的重要标志之一，常用8.0 μm Transwell小室，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
细胞侵袭实验
上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
5、动物活体实验
Dir染料标记外泌体，通过尾静脉注射Dir-labeled Exosome，24小时内观察外泌体在体内的分布情况，以及分离不同脏器观察外泌体的分布情况。
这简直就是文章发表级别的图片，老师再也不用担心我的实验结果图片不够美观，不够档次，拉低文章水平了~~~
不知不觉，来到尾声，今次跟大家分享了恩博家能够开展的部分功能学实验结果展示。(不舍，蓝瘦)。恩博有一肚子的素材，后续会持续分享外泌体功能学研究套路与相关实验，持续关注噢。恩博做啥都追求专业，俺们不是喊口号，你懂的。
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