咖啡可谓是当代打工人的续命神器，随之而来的“咖啡文化”，充满生活中每个时刻——无论在家里、办公室，或是各种社交场合，我们都能看到咖啡的身影。咖啡，逐渐与时尚、现代生活、工作和休闲娱乐联系在一起。
与此同时，与咖啡相关的科学研究也越来越多。以往的研究表明，喝咖啡不仅不会损害心脏，适量饮用还能大大降低心血管疾病的发病率，延年益寿。
近日，来自丹麦哥本哈根大学的一项研究表明：在咖啡中入牛奶，可以增强咖啡的抗炎作用，使免疫细胞的抗炎效果翻倍。该研究题为“Phenolic Acid-Amino Acid Adducts ExertDistinct Immunomodulatory Effects in Macrophages Compared to Parent PhenolicAcids”，发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry杂志。
一、研究背景
当细菌、病毒或其他外来物质进入人体时，我们的免疫系统会通过部署白细胞和化学物质来保护我们，这种反应通称为「炎症」。
咖啡酸（CA）和绿原酸（CGA）是植物源性食品和饮料中常见的酚酸，它们与半胱氨酸（Cys）的对应加合物已在含咖啡的饮料中检测到。尽管有充分证明，CA和CGA具有抗氧化和抗炎活性，但Cys加合物（CA-Cys和CGA-Cys）的免疫调节活性尚不清楚。因此，科学家们合成了加合物，在脂多糖（LPS）处理的RAW 264.7细胞中研究了它们的免疫调节作用，并与母体酚酸的活性进行了比较。
之所以使用RAW 264.7细胞系，是因为大量研究表明，酚类化合物的生物活性在RAW 264.7细胞和原代人免疫细胞中相似。首先，研究人员研究了CA-Cys和CGA-Cys对细胞转录组反应的影响，以探索CA-Cys和CGA-Cys是否可以在转录水平上调节细胞信号传导。接着，通过研究PGE2生成、白细胞介素-6 （IL-6） 和 LPS 活化细胞中的肿瘤坏死因子-α （TNF-α）来比较CA-Cys，CGA-Cys与 CA 和 CGA 的抗炎活性。
二、研究方法
1、CA-Cys和CGA-Cys加合物的合成和纯化
CA和CGA的醌是使用高碘酸盐树脂生成的。将CA（或CGA）和Cys之间摩尔比为1：1的反应混合物在室温下搅拌并在磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中搅拌24小时。此后，采用带有Eurospher 100-5 C18色谱柱（直径300 × 8 mm，5 μm颗粒）的半制备高效液相色谱（HPLC）系统进行纯化。将混合的馏分干燥并溶解在水中并储存在-20°C。CA–Cys和CGA–Cys储备溶液的浓度分别为204 μg/mL（相当于681.6 μM）和210 μg/mL（相当于443.6 μM）。CA-Cys和CGA-Cys的纯度（基于HPLC色谱图验证）分别为99.8%和99.7%。
2、细胞培养
RAW 264.7 巨噬细胞 （ATCC-TIB-71） 在 DMEM中培养，含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。将细胞培养物保持在37°C，含5%CO2的环境中。
3、细胞刺激
264.7 细胞 （1 × 105每毫升细胞）分成24孔板贴壁2小时；然后将 10、50 或 100 μM 的 CA、CA–Cys、CGA 或 CGA-Cys 溶解在 Milli-Q 水中，并加入无血清 DMEM 进行 30 分钟的预抑制；然后加入500ng/mL LPS刺激细胞6和24小时。用相应的酚酸或加合物刺激264小时后，根据RNeasy试剂盒提取RAW 7.6细胞的mRNA。培养24小时后，收集来自细胞的上清液并储存在-20°C直至进一步分析。样品命名为CA，CA-Cys，CGA或CGA-Cys，分别代表暴露于CA，CA-Cys，CGA或CGA-Cys的LPS激活细胞。
4、细胞活力测试
使用PrestoBlue测定法评估细胞活力。
5、用ELISA测定PEG2、IL-6 和 TNF-α的分泌水平。
6、核糖核酸测序
从培养细胞中提取的RNA用于RNA测序，序列数据可在GEO获得。
7、PCR检查RNA转录水平。
8、真空度测量
在刺激24小时后收集细胞并用温热（37°C）无血清DMEM洗涤。2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，10μM）用于在30°C下染色细胞37分钟。然后，在使用流式细胞术测量荧光强度之前，用温热（37°C）无血清DMEM洗涤三次除去DCFH-DA。
三、研究结果
在研究中，研究者为了探究多酚与蛋白质结合的抗炎作用，将人工炎症应用于免疫细胞。其中，部分细胞接受了与氨基酸反应的不同剂量的多酚，而另一些细胞仅接受相同剂量的多酚；对照组什么也没收到。结果研究人员观察到：用多酚和氨基酸组合处理的免疫细胞在对抗炎症方面的效果，是仅添加多酚的细胞的两倍。
用 264 μMCA、CA-Cys、CGA 或 CGA–Cys 培养的 LPS 刺激的 RAW 7.100巨噬细胞中的细胞内 ROS。
实际上，咖啡豆富含多酚，而牛奶则富含蛋白质。因此，本项研究中，研究人员发现：在加牛奶的咖啡中，多酚和蛋白质之间也会发生反应。
CA，CA-Cys，CGA和CGA-Cys抑制RAW 264.7细胞中的促炎细胞因子分泌。
三、总结
“在酚酸中添加Cys导致巨噬细胞活性发生如此剧烈变化”的原因，还需要进一步研究。已有研究证明，多酚被先天免疫细胞内化，然后它们会输送到溶酶体。因此可以推测，Cys的添加调节了这种内化和/或贩运过程，但还需要进一步的实验来验证这一点。此外，研究人员从转录组学分析中观察到的部分炎症分子被抑制，而另有加合物增强，这表明CA和CGA的抗炎作用存在复杂的调节。这些酚酸调节巨噬细胞炎症反应的机制可能是多方面的，涉及多种途径，例如抑制NF-κB信号传导和细胞自噬。
目前，该研究结果提供了关于酚酸-氨基酸加合物免疫调节活性的第一组独特数据，表明：这些经过充分研究的酚酸的生物活性，因Cys加合物的形成，而发生实质性改变；这一点很重要，因为考虑到食品中会存在这种加合物。此研究结果，可作为酚类化合物和氨基酸形成的加合物在未来功能性食品或药品中应用的重要参考，旨在调节代谢、神经或免疫相关疾病。
由此可见，咖啡加奶有抗炎奇效！但是喝咖啡也要适度，不要贪杯哟~
来源：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.2c06658
撰写：Catherine