糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病的严重并发症之一，已成为一个日趋严重的全球性健康问题，目前大陆糖尿病患者大约为9500万，还有约1.5亿患者处于糖尿病前期阶段[1]。1型和2型糖尿病均可发展为DN，DN主要由微血管病变引起，是导致糖尿病患者终末期肾功能衰竭甚至死亡的重要因素，但现代医学针对DN缺乏特异性有效的治疗方法[2]。因此，寻找预防和治疗的新靶点已成为治疗DN急需解决的问题。
高糖诱导的氧化应激、线粒体损伤等导致肾足细胞凋亡和功能损伤，是推进DN发生发展的重要因素。足细胞是肾小球滤过膜的最后一道屏障，蛋白尿是肾小球滤过屏障受损的标志，DN的进展与足细胞功能障碍密切相关，但其作用机制尚未明确[3-4]。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是DN中足细胞功能障碍和足细胞减少的潜在机制，当受到损伤时，足细胞会发生一系列的表型改变，其高度特化的足细胞标志物如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin）、P-钙黏蛋白（P-cadherin）停止表达，而纤维细胞特异蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）、Desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等开始表达[5]。
复方仙草颗粒由八仙草、三七、黄芪、（制）大黄、薏苡仁、甘草组成，有健脾益肾、清热利湿、活血解毒之功效，是壮医有效验方，临床应用证实该方能够改善早期DN患者的肾功能、内皮功能、血液流变学及免疫功能[6]，并对IgA肾病起到有效的治疗作用[7]；能够影响肾脏线粒体自噬从而保护肾功能，抑制肾损伤[8]。毒理研究显示该方安全无毒[9]，并制定了行业质量标准（以人参皂苷Rb1计）[10]。本研究拟从分子细胞水平、基因水平阐述复方仙草颗粒对DN大鼠与EMT相关指标的影响，为复方仙草颗粒的临床应用提供科学依据。
复方仙草颗粒对DN大鼠一般情况和肾脏外观的影响
对照组和假手术组大鼠毛发顺滑，反应灵敏，一般情况较好；模型组大鼠精神欠佳，反应迟钝，毛发枯黄杂乱，掉毛严重，身上出现斑秃现象，进食量和饮水量与日剧增，但体质量减轻，尿量增多。各给药组大鼠相较于模型组大鼠精神稍好，反应稍迟钝，进食量和饮水量相较于对照组大鼠增加，但少于模型组大鼠，体质量变化起伏不大。
如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠由于单侧肾切除术后仅有1个肾脏进行全身的代谢活动并且无药物干预，因此肾脏明显大于对照组大鼠肾脏；与模型组比较，各给药组肾脏略小于模型组大鼠肾脏，且各组间基本无差别。
复方仙草颗粒对DN大鼠KI及肾功能的影响
如表2所示，与对照组比较，假手术组大鼠KI、UACR、BUN无统计学差异，模型组大鼠KI、UACR和BUN水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠KI、UACR和BUN水平均显著降低（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的影响
如表3所示，与对照组比较，假手术组大鼠FBG、FINS及HOMA-IR无统计学差异，模型组大鼠FBG、HOMA-IR均显著升高（P＜0.05），FINS显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠FBG、HOMA-IR均显著降低（P＜0.05），FINS显著升高（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠肾组织病理及足细胞超微结构的影响
如图2所示，HE染色结果显示，对照组和假手术组大鼠肾组织结构正常，肾小管上皮细胞未见明显变性，肾小球结构正常，系膜细胞未见增生，组织未见明显炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组大鼠肾组织结构重度异常，肾小管广泛扩张，上皮细胞变性脱落，部分上皮细胞气球样变，胞质完整消失，间质可见少量炎症细胞浸润，肾小球肥大，毛细血管袢扩张；与模型组比较，各给药组肾组织各种损伤较轻，部分肾小管扩张，个别肾小管上皮细胞数量减少并可见气球样变，肾小球轻度肥大，未见炎症细胞浸润。
TEM结果显示，假手术组大鼠肾皮质与对照组无明显差异；模型组大鼠足突约有80%融合，部分足突变宽，基底膜局部增宽，厚薄不均匀，线粒体可见轻度肿胀，大小不均，部分嵴减少，基质溶解空泡变。与模型组比较，厄贝沙坦组和复方仙草颗粒高剂量组足突融合40%左右，基底膜厚薄较均匀；复方仙草颗粒低剂量组足突融合程度70%左右，基底膜局部增宽，线粒体未见肿胀；复方仙草颗粒中剂量组足突融合程度60%左右，基底膜局部增宽，线粒体未见肿胀。
免疫组化法检测肾组织足细胞标志物和EMT标志物蛋白表达
如图3和表4所示，与对照组比较，假手术组大鼠EMT标志物（Desmin、α-SMA、FSP-1）和足细胞标志物（nephrin、P-cadherin）蛋白表达无统计学差异意义，模型组大鼠肾组织Desmin、α-SMA、FSP-1蛋白表达显著升高（P＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组α-SMA蛋白表达显著降低（P＜0.05），nephrin蛋白表达显著升高（P＜0.05）；厄贝沙坦组和复方仙草颗粒中、高剂量组Desmin、FSP-1蛋白表达显著降低（P＜0.05），P-cadherin蛋白表达显著升高（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠肾组织α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表达的影响
如表5所示，与对照组比较，假手术组大鼠肾组织α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表达无统计学差异，模型组大鼠肾组织α-SMA、Desmin、FSP-1 mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05），nephrin、P-cadherin mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织α-SMA、Desmin、FSP-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），nephrin、P-cadherin mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠肾组织IRS2、PI3K和FOXO4 mRNA表达的影响
如表6所示，与对照组比较，假手术组大鼠肾组织IRS2、PI3K和FOXO4 mRNA表达无统计学差异，模型组大鼠肾组织IRS2、FOXO4 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），PI3K mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织IRS2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），PI3K、FOXO4 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠肾组织α-SMA、nephrin、P-cadherin和Desmin蛋白表达的影响
如图4和表7所示，与对照组比较，假手术组大鼠肾组织α-SMA、Desmin蛋白表达无统计学差异，模型组大鼠肾组织α-SMA、Desmin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织α-SMA、Desmin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。
复方仙草颗粒对DN大鼠肾组织IRS2/PI3K/ FOXO4信号通路相关蛋白表达的影响
如图5和表8所示，与对照组比较，假手术组大鼠肾组织IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、FOXO4蛋白表达无统计学差异，模型组大鼠肾组织p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。
讨论
糖尿病是由于胰岛素分泌相对或绝对不足、靶细胞胰岛素敏感性下降或胰岛素自身结构缺陷而导致代谢紊乱的慢性疾病[15-16]。持续性高血糖、胰岛素抵抗和脂代谢紊乱可导致DN、糖尿病足和神经病变等一系列并发症。肾足细胞是黏附于肾小球基底膜外侧高度分化的细胞，与肾小球血管内皮细胞、基底膜共同构成肾小球滤过屏障[17]。EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有特定表型细胞的生物学过程，是肾间质纤维化和肾功能丧失的主要机制之一[18]。研究表明，当足细胞出现EMT时，可促使足细胞具有运动性，导致足细胞三维结构及表型破坏，进而使其骨架改变[19]，是肾足细胞脱落和凋亡前的一个过程[17]。
本研究发现复方仙草颗粒干预后，DN大鼠肾组织病理形态改善，足细胞足突融合减少，基底膜厚度相对均一，线粒体未见肿胀，高度特化的足细胞标志物nephrin、P-cadherin蛋白表达显著增加，而EMT标志蛋白α-SMA、Desmin、FSP-1等表达则显著降低。表明复方仙草颗粒能够改善DN足细胞损伤，抑制肾足细胞EMT，改善肾功能。
厄贝沙坦为血管紧张素II受体拮抗剂，能够选择性切断血管紧张素转换酶I和受体血管紧张素II结合，减少醛固酮分泌从而控制血管收缩，减轻肾脏损害[20]，具有降血压、减少蛋白尿、组织相容性好、脂溶性高等特点，能选择性对出球小动脉进行扩张[21]，从而降低肾小球内高压情况，改善肾小球的高滤过[22]；并且能够明显改善肾足细胞相关标志蛋白表达，保护肾足细胞，改善肾功能[23-24]；对肾组织的炎症因子有抑制作用[25]，能够延缓肾间质的纤维化[26]。研究已证实，厄贝沙坦能够激活PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）[27-28]、IRS2/PI3K/葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）[29-30]等信号通路，因此选用厄贝沙坦作为阳性对照药物。
胰岛β细胞功能受损引发胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗是引起2型糖尿病的重要发病机制[31]。IRS2是有丝分裂发生的主要介质[32]，能够调节胰岛素、胰岛素样生长因子1等细胞因子；p-IRS2可以激活PI3K/Akt通路[33-36]，从而介导FOXO4活性。FOXO因子可与多种靶基因的启动子结合，并控制细胞内环境稳定的几个关键过程[3]，大量研究证明，FOXO作为调节下游靶基因以抵消细胞压力的转录因子，调控体内的氧化应激、代谢、免疫以及细胞凋亡等生物过程[32-33]。研究表明，IRS2与肾皮质纤维化有关[37-38]，PI3K能够改善DN大鼠肾脏细胞的葡萄糖代谢和水盐代谢紊乱[38]，也可通过Akt途径上调FOXO3、FOXO3a、FOXO4[39-41]。
FOXO4与糖尿病及其并发症的发生发展起关键性作用，且具有促进细胞增殖[42]、抗肿瘤细胞转移的作用[43]。本研究结果表明复方仙草颗粒能够改善DN大鼠胰岛素功能，从而分泌胰岛素，与胰岛素受体结合，导致胰岛素磷酸化和IRS2酪氨酸位点磷酸化，p-IRS2可以激活PI3K及其下游分子[33-35]，促进葡萄糖转运及糖原合成。酪氨酸磷酸化后的IRS2与PI3K的调节亚基p85结合，进而激活PI3K。活化的PI3K将磷脂酰肌醇一磷酸转化为磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作为其第二信使激活Akt[36,44-45]，从而介导FOXO家族的活性。
综上所述，复方仙草颗粒能够改善DN大鼠足细胞EMT，减轻足细胞损伤，具有较好的保护肾脏的作用，其作用机制可能与调控IRS2/PI3K/FOXO4信号通路有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：刘丹宁，黄国东，杨鑫勇，周嫦艳，王亚南．基于IRS2/PI3K/FOXO4信号通路研究复方仙草颗粒抑制糖尿病肾病足细胞上皮-间充质转化的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6795-6804 .