Genics Pty Ltd的首席执行官兼董事总经理Melony Sellars博士最近开发了四种新的实时PCR检测方法，可以帮助检测对虾中是否存在十足目虹彩病毒 (DIV1)。
20年来，Melony Sellars一直在研究和确定全球虾产业的解决方案
Genics创立2018年， Melony Sellars博士在澳大利亚联邦研究机构（CSIRO）工作了20年，并一直寻找虾业最大挑战的解决方案，即：在虾饲料中替代鱼粉的可行性、以及满足高密度对虾养殖的要求，并帮助建立了不同对虾种类的商业育种计划。Sellars还使用基因组工具来帮助推进对虾的遗传选择、 帮助病原体诊断，以及开发用于虾类养殖的抗病毒药物和RNAi干扰物。
Melony Sellars博士表示：“这段经历让我能够与世界各地的商业对虾养殖客户进行互动，让我了解他们面临的最大挑战，并制定解决他们问题的解决方案。”
2022年初，Genics开发了四种新的实时PCR检测方法，有助于准确可靠地检测虾中是否存在十足目虹彩病毒，并且将新的病原体检测方法发表在《世界水产养殖学会杂志》上。
一、对虾养殖中的病原体和疾病监测
Sellars解释说，在许多疾病检测策略发展之前，虾产业就开始取得进展。养殖户很快了解到，在任何时间，水产养殖环境中都存在一长串病原体，而且增加养殖密度会增加其系统中病原体的类型和数量。疾病爆发仍然是全球虾类养殖面临的最大挑战之一，它破坏对虾的质量，并侵蚀养殖户的利润。
南美白对虾：尽管细菌和病毒性疾病仍然是一项重大挑战，但该行业有更多工具可用于应对疾病
然而， 自对虾行业发展以来，研究人员在疾病检测和监测方面取得了多项突破。
Sellars说道：“我们对不同临床症状的病原体，或者我们在虾中看到的病态症状，已经取得重要的了解。鱼类兽医也更多地了解了不同虾病原体的流行病学。关于这些病毒、细菌和真菌在水产养殖环境中的表现，以及它们如何复制的关键信息已经确立。这使得疾病检测和治疗方案变得更加容易。”
除了这些生态参数之外，科学家们还更多地了解了基因测序及其检测病原体独特DNA特征的能力。研究人员现在可以使用可以检测和测量目标对象的存在、或者来识别单个病原体的DNA谱。当这些检测利用聚合酶链式反应 (PCR)（一种快速扩增组织样本DNA序列的化学反应）时，研究人员可以构建强大的工具来测量水产养殖环境中引起疾病的病原体的存在和流行情况。
尽管取得了这些进展，但研究人员在病原体监测和建立新型虾病原体测试系统时，仍面临多重挑战。一是临床样本中存在PCR抑制剂，例如：甲壳素——虾外骨骼的主要成分。甲壳素可以阻止反应的发生，并导致PCR数据出现假阴性。为了克服这个问题，研究人员需要使用额外的对照PCR检测，来确保样品中甲壳素或其他抑制物质的含量不会阻止PCR反应。
Sellars教授解释说：“很少有实验室和测试平台能够对提取的每个样本进行对照测试。如果是这样，养殖户可能会得到假阴性，在应对疾病爆发时阻碍他们采取下一步行动。”
考虑到这些测试要求可能会变得昂贵，因此，研究人员正在设计方法来保持对虾病原体检测在经济上可行。Sellars说：“Genics的团队在一次测试中成功地将病原体和对照检测分析结合在一起 。这种“多重”方法（单一测试可以在一个反应中检测多个目标病原体），可以将两个或多个反应变成更少或一个反应。”
在开发新的病原体检测时，另一个相当大的挑战是获得感染了目标病原体的虾样本。临床患病虾的样本对于开发和验证新的检测方法至关重要。Sellars强调，研究人员需要来自不同养殖系统的数百个感染病原体的虾样本，来完全验证一种检测方法。
Sellar博士在澳大利亚的Genics实验室：Sellars博士和她的团队想要设计一种实用的工具，可以检测组织样本中是否存在多种病原体
水产养殖环境中存在多种病原体这一事实是另一个障碍。虾在任何时候都可能感染多达四种不同的病原体，养殖户永远无法确定池塘中存在哪种病原体。这意味着很少有养殖户测试他们的动物中可能存在的所有病原体（主要是由于成本限制）。这让他们对自家虾塘的情况缺少了解，并且难以在养殖的过程当中做出正确的决策。
Sellars说道，“虾产业需要能够准确可靠地检测组织样本中，存在多种病原体的实用工具。创建和商业化这些工具将确保虾产业在疾病爆发之前保持领先，并可以跟踪养殖系统中病原体的低水平存在和流行，预测和减轻疾病风险。”
二、十足目虹彩病毒（DIV1）的出现
新型十足目虹彩病毒感染于2014年首次在中国被发现，并在中国沿海的多个养虾场造成对虾大量死亡。DIV1感染的目标是形成血液和免疫细胞的组织、鳃和肝胰腺。对虾的DIV1感染可出现临床症状，如：软壳、肝胰腺萎缩、体色苍白或淡黄色、空肠空腹，一些垂死的虾的腹部肌肉呈现出略带白色的颜色。养殖户和研究人员注意到感染DIV1虾的死亡率高得惊人，因此，需要更好的病毒检测和治疗方法。
自从首次发现和测序以来，该病毒仍然是全球虾业面临的重要新兴病原体威胁。2020年，DIV1在台湾被发现，破坏了岛上的小龙虾和对虾产业 。自那次爆发以来，研究人员已经在来自印度洋的野生捕捞亲虾标本中发现了这种病毒，尽管这些动物没有表现出任何疾病的临床症状。这引发了人们对虾可能成为DIV1宿主的担忧，从而促进其在亚太地区的传播， 并使病毒进一步根深蒂固。
印度尼西亚的虾塘：由于虾塘在任何特定时间都可能包含多种病原体，因此维持生物安全至关重要。
在与Genics的实地研究中，Sellars注意到针对DIV1发布的PCR分析存在一些性能限制。其中一些可能归因于病毒的新颖性——它仅在八年前被发现和测序。可用的分析显示，它们的引物形成所谓的引物二聚体存在问题，它们粘在一起并且无法正常工作，而其他分析在某些情况下存在特异性问题。
Sellars表示 ，当他们进入一个养殖场时很幸运，该养殖场报告其池塘中有大量死亡，但尚未确定病原体。该养殖场愿意提供虾组织样本用于研究和开发目的。
Genics的团队排除了所有其他可能的已知病原体，但在他们的调查过程中能够扩增十足目虹彩病毒。该团队决定将他们的研究工作集中在开发新的、更准确的DIV1检测方法上。为此，Genics团队需要识别和分离病毒的替代靶基因。Sellars和她的团队从受DIV1影响的池塘中提取了额外的病毒DNA样本，从而建立了更广泛的病毒遗传物质基础。在对其进行排序后，她和她的团队有了一个更完整的模板可供使用，他们离设计一种新的病原体检测平台又近了一步。
三、为DIV1开发一种新的PCR检测方法
Sellars说道：“PCR分析以多种不同的方式工作，但通常，它们都从DNA或RNA提取过程开始，然后是使用所谓的引物进行的扩增过程。引物通常包含21到24个碱基对DNA，构成DNA双链的As、Ts、Gs 和 Cs。如果样本中存在目标病毒，则引物的遗传碱基对以特定序列的方式“坐在”病毒的遗传上。一个在左边，一个在右边。”
将DNA样本放在PCR反应板上后，研究人员将酶和试剂添加到样本中，使引物能够产生与目标病原体相同的短链合成DNA。一旦在PCR机器或热循环仪中通过多个加热和冷却循环创建这些链，它们就可以在专用设备上以不同的方式可视化。
Sellars 解释说：“这是一般概述，但还有更复杂的系统，如：RT-PCR或嵌套PCR测试、实时PCR或多路径PCR，它们在复制的DNA中结合了多个引物和荧光染料，”
Sellars和她的团队能够识别和分离DIV1的替代靶基因，并开发新的检测方法
对于DIV1的工作，Sellars决定设计一种实时PCR检测方法，在高密度反应板上使用引物对和探测对的组合。Sellars说道：“额外的探针使您可以利用检测的更高灵敏度和更高的特异性。采用这种方法，可以在一次测试中包含多种检测，让养殖户和研究人员获得准确且特定于DIV1的结果。”
四、新的PCR检测对DIV1的重要性
Sellars说，这些检测方法有助于对DIV1进行实用且具有成本效益的疾病监测。从更广泛的意义上看，它使该行业能够使用更多的监测工具，并且可以成为为虾农建立疾病早期预警系统的第一步。如果养殖户掌握了这些信息，他们可以采取措施来阻止疾病爆发。新的检测方法为提高虾类水产养殖的生物安全准备奠定了关键基础。
五、疾病检测的下一步是什么？
根据Sellars的说法，在检测疾病方面，虾行业越来越要求即时的检测。
Sellars说：“即时检测非常适合确认我们是否有生病的动物。未来可能会采用能够检测养殖户注意到虾的疾病，或者疾病临床迹象前几周检测病原体存在的技术。在疾病爆发前，识别病原体，并结合适当的管理，可以有效防止对虾死亡，并使养虾场更有利可图。这样，养殖户可以在虾生病前几周拥有预警系统。”
泰国的一个养虾场
“我看到一个行业现象，我们所有人都致力于早期病原体检测、早期疾病的解决方案，以达到我们努力减少病原体在我们的池塘、养殖场内传播。”
六、密切关注养殖密度
尽管早期病原体检测将改变对虾养殖业，但Sellars看到了即将到来的一个突出挑战：养殖密度。
Sellars说，行业必须开始生产具有高健康性能的健壮虾，这些虾可以在集约化养殖条件下茁壮成长。她还指出，环境可持续的生产方法，如：循环水产养殖系统 (RAS)，也需要将虾的健康放在首位。
“RAS带来了病原体的巨大挑战，尤其是细菌感染，循环系统可以迅速传播病原体。当系统以高密度养殖时，这可能是灾难性的、随着越来越多的养殖户选择循环系统，早期疾病检测将成为常规要求。”
“对虾养殖需要想出更好的方法来管理疾病风险，并改进识别疾病的临床症状，达到改善对虾养殖的成功率。”