在专利的世界中，不管是阵地战还是遭遇战，都是场血雨腥风的恶战。这既有自我防卫的据理力争，又有攻城把寨的昭然野心，都不夹杂太多个人的喜恶。
这篇文章就以牛津奈米谱ONT公司在过去十多年的专利遭遇战来盘盘Illumina、Pacbio和ONT三家测序巨头的爱恨情仇。
ONT创立于2005年，那个时候距David Deamer第一个纳米孔测序的构思已经过去了16年，而距第一个纳米孔测序专利提交也已经过去了10年。ONT在2014年推出了商业化产品的早期访问，距离公司成立过去了将近十个年头。纳米孔测序这十年一个周期的发展无疑是学术界和以ONT为首的商业公司一起推动的。
在高通量测序的发展历史中，纳米孔测序无需荧光标记、可在单分子水平上、直接通过电信号识别核酸碱基（因此带来的速度和成本、工作流程的简化）的优势，现在看来愈加明显，而在技术发展的早期，这也是一些公司和资本投注的基本出发点，这就包括测序大厂Illumina。
2009年初，Illumina投资1800 万美元（获取13.5%的股权）入主了才成立不久的ONT公司，也是在刚收购Solexa后的第二年。然而，此时的ONT公司才刚刚明确了基因测序的战略发展方向，更别说拥有完善的技术路线和技术验证了。Illumina押注的是正是ONT在摸索的其中一条技术路线，称为BASE (Bayley Sequencing) 技术，其本质上通过核酸外切酶将 DNA 链中切割出的单个碱基送入纳米孔，通过引起的不同电信号从而测定序列。这与ONT现行的链穿孔测序完全不同，而实际上随着科学界不断摸索提示了链测序的可行性和优势后，ONT也完全放弃了核酸外切酶路线。这种转变跳出了Illumina合作协议的范畴，而ONT也无意在链测序技术上再绑定Illumina进行后续的商业化。2013年，恼怒的Illumina提脚淌出了这滩浑水，以 5520 万美元的价格出售了其股份。四年三倍的回报看起来是个不错的投资，但这显然已经违背了Illumina的本意，自然也是结下了梁子。
两种不同的纳米孔测序思路
2016年初，在ONT推出自己的测序仪第二年，Illumina在美国起诉ONT专利侵权。这似乎是意料之外，但在情理之中。诉讼的核心是耻垢分枝杆菌孔蛋白A (MspA)纳米孔，这与早期纳米孔研究所普遍使用的α-溶血素蛋白孔不同。事实上，华盛顿大学的生物物理学家Jens Gundlach在2008年发现MspA孔可以用于识别单分子DNA，并与阿拉巴马大学伯明翰分校的微生物学家 Michael Niederweis 合作开发其用于 DNA 测序。这在一定程度上也为ONT开发自己的链测序提供了灵感和思路。但神奇的是，就在出售ONT股份的同一年底，Illumina 抢先从阿拉巴马大学伯明翰研究基金会和华盛顿大学独家授权了Msp蛋白用于核酸测序的专利。
MspA纳米孔蛋白用于测序
虽然，ONT至今都没有披露其最初商业化设备中所使用的具体纳米孔，但从Illumina诉讼要求赔偿这一事实来看，ONT大概率也是在商业化产品中使用了Msp蛋白的特定变体。这一起诉在当时似乎影响到ONT的几乎全部商业化成果，包括唯一上市的MinION，以及宣布将来上市的PromethION。
2016年3月，ONT CTO在技术更新讲座上使用了“不，谢谢，我们已经有一个了”的题目。
然而，峰回路转的是，在同年3 月，ONT宣布与比利时根特 VIB 的 Han Remaut 实验室合作开发并独家授权了一种全新的R9纳米孔- CsgG，并筛选 700 多个蛋白突变，打算很快为 MinION 和 PromethION 系统提供包含新 R9 孔的流通池，停止之前所使用的R7 流通池。最终ONT选择和Illumina庭外和解，同意销毁当时在售的所有产品，并不再出口或售卖包含涉诉专利纳米孔的产品。
只此一役，Illumina虽然占得了上风，但自此再难与ONT回到谈判桌前，从此多了一个对手。ONT在长读长测序商业化方面的积极进展也迫使Illumina提出收购Pacbio公司来补全自己在长读长测序方面的不足。而在收购Pacbio受到英国竞争和市场管理局(CMA)的审查时，ONT也提供了自己不赞成这一收购的证词。
除了Illumina，同是标榜长读长测序技术，ONT更是在过去的六七年与Pacbio展开了专利拉锯战，从美国到英国，打到了各自的大本营。
2016/2017年间，Pacbio公司先后在美国、英国和德国对ONT发起了专利诉讼，状告ONT侵权。起初这些涉诉的专利都涉及一种通过在末端添加发夹接头将双链 DNA 片段转化为环状的方法，从而可以对正义链和反义链进行测序，这就是 Pacbio 用于其环状共有测序CCS的一种方法。ONT在早期的技术开发以及早期的产品版本中，的确是在靶标双链DNA的末端连接发夹接头，通过马达蛋白引导两条链（模版+接头+互补链）穿孔读取序列，其称之为2D读取。
Pacbio专利申请保护的发夹接头，及纳米孔测序早期的2D读取流程
很快在2018年，针对英国和德国的诉讼，两家公司就达成了和解协议，这一协议为期五年。根据条款，ONT同意到 2023 年底不在英国或德国制造、处置、使用或进口任何“2D”纳米孔测序产品。在此期间，Pacbio不对 ONT或其在英、德的客户进行发夹接头相关专利进行起诉。Pacbio在ONT的大本营取得了诉讼的胜利。事实是，Pacbio 的发夹接头成环专利将直到 2029 年 3 月 27 日才到期。
然而，在美国的情况却大不一样。美国国际贸易委员会（ITC）在2018年初停止了相关调查，认定ONT不侵权。理由是，ITC解释“单分子测序”一词仅限于合成测序方法，因此 ONT的测序方法不是“单分子测序”。
无论如何，ONT认为2D 也已经过时，2017 年 5 月将其在全球停产，以更优越的 1D^2 方法取而代之。1D^2与2D，以及单条链读取的1D，都不太一样，其不是通过发夹接头进行物理连接，而是将每条链分别连接到一个特殊的接头上，这样模版链读取完之后，互补链可以随即被同一个纳米孔捕获，为双链DNA生成与2D类似的共有序列。而ONT停产2D的原因正是1D^2 读数的平均准确度比2D还要高。
三种不同的纳米孔读取方式示意
放弃2D，顺势进入1D^2，使得ONT在Pacbio诉讼的第一阶段，有惊无险。但由于实际操作效果并不理想，在后来的发展中，ONT 也不再提供或支持1D^2，仅支持 1D 单链测序方法。离共有序列这一方法渐行渐远，也使得ONT在提升读取准确率这一最头痛的问题上不得不寻求其他可能的出路，也因此耗费了不少时间。
值得一提的是，ONT在2021年推出duplex方法，本质上和1D^2无异，但在提升互补链捕获效率上还有很大空间；后来其提出的inny/outy“牙线”共识测序方法，也都是可圈可点。搜索关注“我是建设者”公众号，后续将专门介绍。
除了在发夹接头技术上对ONT发起的进攻，Pacbio还在美国针对纳米孔测序技术本身提起了对ONT的诉讼。没错，Pacbio在发展的早期阶段，也申请了纳米孔测序的技术专利。
然而不管是州法院还是联邦法院都一致认定了Pacbio 纳米孔测序专利无效。审判过程涉及到新冠等原因，比较周折却很有趣。本质上，联邦法院认定Pacbio专利的权利要求没有区分要测序的“模板核酸”的特定类型或“特征”。陪审团听取了关键研究人员的证词，证明生物 DNA 分子第一次成功的纳米孔测序直到 2011 年才出现；在 2012 年该领域的科学家会议（AGBT）上，ONT展示了使用自己的技术成功测序生物 DNA 的数据，700 名观众的反应是明显兴奋的。陪审团还听取了证词，Pacbio 承认在截至 2009 年专利优先日期前，它实际上并没有将声称的权利要求付诸实践，也没有进行任何类型的纳米孔测序。因此，法院认定相关专利的披露需要进行过度实验才能实现所主张权利要求的全部范围，因而无效。这无疑认定了ONT在DNA纳米孔测序方面的强大地位和技术实力。
自2016年以来，Pacbio与ONT的专利诉讼中，Pacbio前前后后打出了共8项专利的底牌，在美国和英国的诉讼中，两家公司各有输赢。这无不提示了专利布局和技术创新的重要性，不管是自己申请还是授权合理使用。这种强大的专利组合布局也为后来者创新构建了足够高的门槛，确保了自己的市场竞争地位。ONT正是通过不断的技术开发和创新，逢山开路、遇水架桥，帮助自己度过了一个个可能覆巢倾卵的危机。而从2018年到2020年，由于跟Pacbio的专利纠纷，ONT披露每年的法律费用高达1000万英镑左右。
除此之外，建设者之前的文章还描述了潜在竞争者—罗氏纳米孔，以及罗氏/Genia所涉及的法律纠纷。事实上，ONT也从加利福尼亚大学董事会（UC Regents）拿到了与纳米孔测序技术相关专利许可（主要是David Deamer和Mark Akeson在UCSC的工作）。Genia（后来被罗氏收购）的共同创始人Roger Chen后来以公司的名义提交了一系列研究生在读期间成果的相关专利申请，这些专利申请的技术与授权给ONT的技术相同。UC Regents就罗氏和Roger Chen提起了诉讼，最终于 2018 年 6 月达成了有利于ONT和 UC Regents的和解。
伴随高通量测序发展的二十多年也是不同公司起起伏伏、跌跌撞撞的二十年，甚至很多创新的技术和想法都没能走到产品化就淹没在了历史大潮中。Illumina、ONT、Pacbio这三大成长起来的测序巨头的爱恨情仇交杂也为后来者提供了不少看点，但更多的是启发，不管是专利布局、技术创新、还是牵手合作分手雨的戏码。
随着三家公司在各自技术手段、产品商业化上的持续、独特发展，也期待下个阶段有更光鲜的舞台、更创新的产品、和更精彩的故事。